本文關(guān)鍵詞：XPD蛋白的線粒體定位及在線粒體DNA氧化性損傷修復(fù)中的功能研究

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【摘要】：著色性干皮癥D(XPD/ERCC2)編碼一種依賴于ATP的解旋酶。XPD在細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄及核苷酸切除修復(fù)(NER)中發(fā)揮必不可少的作用。在細(xì)胞質(zhì)中,XPD與MMS19形成MMXD復(fù)合物在染色體分離及紡錘絲形成中起主要作用。與細(xì)胞核DNA相比線粒體DNA中的氧化性損傷是細(xì)胞核中的幾倍。XPD缺陷細(xì)胞的DNA對于氧化性損傷敏感。XPD在維持基因組穩(wěn)定性上的作用已經(jīng)得到了很好的證實(shí),但是XPD在線粒體DNA的氧化性損傷修復(fù)中是否其起類似的作用仍然是未知的。本研究第一次證明XPD定位于線粒體內(nèi)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示XPD定位于細(xì)胞核,細(xì)胞質(zhì)及線粒體中。通過Western blotting分析提取的細(xì)胞組分,進(jìn)一步證實(shí)了XPD蛋白定位于線粒體內(nèi)。通過蛋白酶K及堿裂解實(shí)驗(yàn)證實(shí)XPD定位于線粒體基質(zhì)中。我們觀察到在氧化性損傷的條件下XPD在線粒體中的蛋白量明顯增加。這一現(xiàn)象明顯表明XPD可能在修復(fù)線粒體DNA氧化性損傷中起關(guān)鍵作用。與XPD在線粒體中的定位一致,在XPD低表達(dá)的U20S細(xì)胞及XPD缺陷的人類成纖維細(xì)胞中,線粒體ROS的產(chǎn)量及由于氧化性損傷產(chǎn)生的線粒體DNA的common deletion的水平明顯升高,而對于線粒體DNA氧化性損傷的修復(fù)能力,細(xì)胞的ATP水平和線粒體的膜電位則明顯降低。實(shí)驗(yàn)表明,XPD的缺陷只是影響了線粒體DNA的氧化性損傷修復(fù)活性,但是對細(xì)胞核基因的修復(fù)并沒有影響。證明XPD在修復(fù)線粒體DNA的氧化性損傷修復(fù)機(jī)制中是一個(gè)關(guān)鍵的因子。通過對線粒體組分的免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析進(jìn)一步檢驗(yàn)在修復(fù)線粒體DNA氧化性損傷中的與XPD可能相互作用的潛在因子。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了兩種經(jīng)典的蛋白MMS19及TUFM蛋白.并且通過免疫共沉淀進(jìn)一步驗(yàn)證了XPD與兩者的相互作用。TUFM是一種線粒體翻譯的延長因子Tu,而MMS19在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中都發(fā)現(xiàn)了可以與XPD相互作用。但是沒有發(fā)現(xiàn)TUFM與MMS19具有相互作用。與XPD缺陷細(xì)胞類似,在TUFM或者M(jìn)MS19低表達(dá)的細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了線粒體common deletion水平的增加及修復(fù)線粒體DNA氧化性損傷能力的降低。因此與XPD類似,TUFM與MMS19也在線粒體DNA氧化性損傷修復(fù)中具有重要作用。我們的發(fā)現(xiàn)明顯表明XPD促進(jìn)有效率的線粒體DNA氧化性損傷修復(fù),在保護(hù)線粒體基因組穩(wěn)定性上具有重要作用。XPD形成兩種復(fù)合物XPD-TUM及XPD-MMS19,這兩種復(fù)合物在修復(fù)線粒體DNA氧化性損傷機(jī)制中發(fā)揮必不可少的作用。
【關(guān)鍵詞】：XPD 線粒體定位 氧化性損傷修復(fù) TUFM MMS19
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院北京基因組研究所
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R758.5
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 專業(yè)詞匯中英文對照表10-14
• 第一章 引言14-42
• 1.1 DNA損傷修復(fù)14-19
• 1.1.1 DNA損傷14
• 1.1.2 細(xì)胞核DNA修復(fù)與線粒體DNA修復(fù)14
• 1.1.3 細(xì)胞核中的DNA修復(fù)途徑14-19
• 1.2 XPD蛋白19-30
• 1.2.1 XPD解旋酶19
• 1.2.2 XPD功能19
• 1.2.3 XPD表型19-22
• 1.2.4 XPD基因型和表型之間的聯(lián)系22-24
• 1.2.5 XPD結(jié)構(gòu)24-25
• 1.2.6 XPD復(fù)合物結(jié)構(gòu)25-30
• 1.3 線粒體30-35
• 1.3.1 線粒體DNA30-31
• 1.3.2 線粒體復(fù)合物31-32
• 1.3.3 ROS的產(chǎn)生及氧化性損傷32-33
• 1.3.4 線粒體修復(fù)33-35
• 1.4 NER因子在保護(hù)及修復(fù)氧化性DNA損傷中的作用35-37
• 1.4.1 轉(zhuǎn)錄伴隨的修復(fù)：CSA,CSB及XPG35
• 1.4.2 全基因組修復(fù)：XPC及XPA35-37
• 1.5 XPD與氧化性損傷修復(fù)37
• 1.6 線粒體疾病37-38
• 1.7 線粒體蛋白質(zhì)翻譯及TUFM蛋白38-40
• 1.7.1 線粒體翻譯38-40
• 1.7.2 TUFM蛋白40
• 1.8 本論文研究內(nèi)容及目的40-42
• 第二章 材料與方法42-64
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料42-48
• 2.1.1 所用細(xì)胞系的信息42-43
• 2.1.2 所用抗體信息43-44
• 2.1.3 所用質(zhì)粒信息44
• 2.1.4 引物序列44-46
• 2.1.5 shRNA,siRNA序列46-47
• 2.1.6 所用化學(xué)試劑及試劑盒47-48
• 2.1.7 實(shí)驗(yàn)儀器48
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法48-64
• 2.2.1 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄48-49
• 2.2.2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建49
• 2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)49-50
• 2.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染50-51
• 2.2.5 過表達(dá)及低表達(dá)細(xì)胞系的建立51
• 2.2.6 免疫熒光51-52
• 2.2.7 細(xì)胞組分分離,蛋白酶K處理及堿裂解提出的線粒體52-53
• 2.2.8 雙氧水處理實(shí)驗(yàn)53-54
• 2.2.9 線粒體超氧化物的測定54
• 2.2.10 ATP水平及線粒體膜電位檢測54-56
• 2.2.11 SDS-PAGE凝膠電泳56-58
• 2.2.12 免疫印跡技術(shù)58-59
• 2.2.13 基因組提取及長片段PCR(QPCR)59-60
• 2.2.14 檢測common deletion60-61
• 2.2.15 大規(guī)模線粒體提取及Co-IP(co-immunoprecipitation)61-64
• 第三章 研究結(jié)果64-93
• 3.1 免疫熒光試驗(yàn)證明XPD蛋白與線粒體具有共定位64-65
• 3.2 XPD蛋白定位于線粒體中65-67
• 3.3 XPD低表達(dá)提高了線粒體中ROS的產(chǎn)量67-69
• 3.4 XPD低表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞中ATP水平及線粒體膜電位的降低69-71
• 3.5 氧化性損傷壓力下XPD在線粒體中的蛋白增加71-72
• 3.6 XPD缺陷導(dǎo)致線粒體DNA產(chǎn)生高水平的common deletion72-73
• 3.7 XPD調(diào)控線粒體DNA修復(fù)73-76
• 3.8 XPD解旋酶活性在XPD調(diào)控的線粒體DNA的修復(fù)中有必不可少的作用76-78
• 3.9 純化XPD蛋白在線粒體中的復(fù)合物78-81
• 3.10 TUFM在線粒體的氧化性損傷修復(fù)中與XPD起相似的作用81-84
• 3.11 XPD與線粒體BER修復(fù)的核苷酸切除修復(fù)蛋白CSA,CSB沒有相互作用84-85
• 3.12 MMS19定位于線粒體中85-87
• 3.13 線粒體中MMS19與XPD形成獨(dú)立于TUFM的復(fù)合物87-88
• 3.14 線粒體中MMS19低表達(dá)影響XPD的表達(dá)88-89
• 3.15 線粒體中MMS19低表達(dá)影響線粒體功能89-91
• 3.16 XPD在線粒體中形成兩種復(fù)合物共同調(diào)控線粒體DNA修復(fù)91-93
• 第四章 分析討論93-97
• 參考文獻(xiàn)97-105
• 作者簡介及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果105

【相似文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉靜;XPD蛋白的線粒體定位及在線粒體DNA氧化性損傷修復(fù)中的功能研究[D];中國科學(xué)院北京基因組研究所;2015年

2 張琪;DNA氧化性損傷的非酶性快速修復(fù)可能存在于細(xì)胞中[D];蘭州大學(xué);2006年

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本文編號(hào)：561512