本文關(guān)鍵詞：特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥致病基因篩選及IVF妊娠結(jié)局分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分KISS1/KISS1R基因與特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥的相關(guān)性研究背景特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥(Idiopathic hypogonadotropic hypogonadism, IHH)是一類少見的生殖內(nèi)分泌疾病。發(fā)生率約為1-10例/10萬人,男性發(fā)病率約為女性的4-5倍。主要臨床特征是：第二性征發(fā)育延遲或缺乏,伴有異常低水平的促性腺激素和性激素。約60%的IHH患者表現(xiàn)為嗅覺缺失或減退,又稱為Kallmann綜合征；40%的IHH患者嗅覺正常,稱為nlHH(IHH with nonanosmia)。男性患者的主要臨床表現(xiàn)為：年齡18歲,血清促性腺激素水平及睪酮水平偏低[卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)3 mIU/ml、睪酮(testosterone, T)300 ng/dl],小睪丸(單側(cè)睪丸體積12ml),伴有射精障礙或無精子癥。女性患者的主要臨床表現(xiàn)為：閉經(jīng),孕激素撤退實驗陰性,雌孕激素撤退后有陰道流血,低促性腺激素水平FSH3mlU/ml、低雌激素水平[雌二醇(estradiol,E2)30pg/ml]。IHH的病因復雜,研究發(fā)現(xiàn)主要發(fā)病機制是促性腺激素釋放激素(Gonadotropic release hormone, GnRH)功能異�；蛎}沖釋放異常導致下丘腦垂體性腺軸功能低下。部分IHH患者呈家族聚集性,提示遺傳因素在IHH發(fā)病中的重要作用,目前候選基因研究主要集中在與GnRH釋放或功能相關(guān)的基因,包括KAL1、FGFR1、PROK2、PROKR2、CHD7、KISS1、KISS1R、LEP、LEPR、 TAC3、TACR3、PCSK1、GnRHR等[1]。KISS1基因編碼Kisspeptin蛋白,由位于下丘腦的Kisspeptin神經(jīng)元分泌。Kisspeptin直接與GnRH神經(jīng)元表面的Kisspeptin受體(KISS1R)結(jié)合,促進GnRH神經(jīng)元釋放GnRH進入垂體門脈循環(huán)系統(tǒng),進而調(diào)控垂體前葉釋放卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)。羊體內(nèi)注射Kisspeptin后,GnRH神經(jīng)元胞體內(nèi)的GnRH mRNA表達增多,腦脊液中GnRH濃度升高,血清FSH、LH水平升高。KISS1或KISS1R基因敲除小鼠表現(xiàn)為低促性腺激素和低性激素水平,類似人IHH臨床表現(xiàn),提示KISS1、KISS1R基因是IHH的候選基因。目的在170例中國IHH患者中,篩查KISS1、KISS1R基因突變,探討KISS1、KISSIR基因與IHH發(fā)病的相關(guān)性。方法募集2008-2013年間于山東大學生殖醫(yī)院就診的170名IHH患者作為研究對象(133名男性,37名女性),同期募集94名健康男性和93例健康女性作為對照組,自外周血提取基因組DNA,應用直接測序法篩查KISS1、KISS1R基因編碼區(qū)。比較基因變異在病例組和對照組間的等位基因頻率和基因型頻率分布,探討基因突變與IHH發(fā)病的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)KISSl基因第1外顯子已知SNP rs12998、第2個外顯子已知SNPrs4889,二者的等位基因及基因型頻率分布與對照組無顯著差異。在1例IHH合并無精癥男性患者中發(fā)現(xiàn)KISS1R基因5’UTR區(qū)的新發(fā)雜合突變(-54C→A),位于KISS1R基因的啟動子區(qū)域,對照組未發(fā)現(xiàn)該突變。結(jié)論首次在KISSIR基因5’UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)新發(fā)突變(-54C→A),其致病作用有待于進一步研究；(ISS1、KISS1R編碼區(qū)變異不是中國IHH患者的常見病因。第二部分TACR3基因在特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥中的作用及機制研究背景IHH病因復雜,研究顯示促性腺激素釋放激素(GnRH)功能異常或脈沖釋放異常導致下丘腦垂體性腺軸功能低下是IHH的可能發(fā)生機制。NKB(neurokinin B) [43]、kisspeptin[35,76]和強啡肽(Dyn)是人類生殖系統(tǒng)發(fā)育和發(fā)揮正常功能不可缺少的神經(jīng)肽,由位于漏斗核或弓狀核上的KNDy神經(jīng)元分泌。NKB與KNDy表面的受體NKR結(jié)合后調(diào)節(jié)kisspeptin的釋放,kisspeptin與位于GnRH神經(jīng)元表面的KISS1R受體結(jié)合,調(diào)節(jié)GnRH的脈沖釋放。NK3R是NKB的高選擇性G蛋白偶聯(lián)受體,NKB與受體結(jié)合后激活細胞內(nèi)PLC-IP3信號途徑引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子內(nèi)流,從而發(fā)揮作用。NK3R蛋白由TACR3基因編碼,TACR3基因變異影響NK3R與NKB的結(jié)合。NKB與NK3R結(jié)合后在不同性激素環(huán)境下可產(chǎn)生兩種截然相反的結(jié)果：促進或抑制GnRH脈沖釋放。在高雌激素環(huán)境下,NKB/NK3R促進kisspeptin釋放,kisspeptin促進GnRH神經(jīng)元釋放GnRH;在低雌激素環(huán)境下,NKB/NK3R抑制LH脈沖釋放,但具體機制尚不清楚。國外學者在IHH患者中發(fā)現(xiàn)TACR3基因突變,體外功能實驗證實突變型TACR3蛋白(NK3R)與配體NKB或senktide結(jié)合,對細胞內(nèi)信號通路的刺激作用減弱,鈣離子內(nèi)流減弱,改變了NK3R的受體功能,導致GnRH、促性腺激素釋放異常。因此,TACR3是IHH的候選基因之目的本研究通過篩查170例中國IHH患者TACR3基因變異,發(fā)現(xiàn)新發(fā)突變并進行體外功能實驗,探討TACR3基因突變在IHH發(fā)病中的作用及機制。方法以2008年3月至2013年11月在山東大學生殖醫(yī)院就診的170名IHH患者作為研究對象(133名男性,37名女性),同期募集的200名健康男性和200例健康女性作為對照組,自外周血提取基因組DNA,應用直接測序法篩查TACR3編碼區(qū)序列變異。使用Clustal W、Polyphen-2、SIFT、Mutation Taster進行生物信息學預測,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、鈣成像實驗及NFAT測鈣實驗分析突變的蛋白受體與配體senktide結(jié)合后細胞內(nèi)信號通路的變化、鈣離子濃度的變化,探討新發(fā)突變的致病作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1例IHH合并無精子癥患者攜帶TACR3基因新發(fā)突變C.1108GT(P.A370S)。A370S位于第5外顯子,在不同物種間高度保守,功能預測提示存在可能致病性。體外鈣成像實驗及NFAT測鈣實驗顯示突變A370S增強了NK3R與配體的結(jié)合及細胞內(nèi)信號通路,改變了NK3R的受體功能。但A370S并不影響NK3R蛋白表達。結(jié)論首次在大樣本中國IHH患者中發(fā)現(xiàn)TACR3基因新發(fā)錯義突變A370S,體外功能實驗證實突變A370S增強了NK3R與配體的結(jié)合及細胞內(nèi)信號通路,改變了NK3R的受體功能,提示該突變可能影響了GnRH和促性腺激素釋放,導致IHH發(fā)病,具體作用機制有待進一步研究。第三部分家族性低促性腺激素性性腺功能減退癥的致病基因篩查背景臨床發(fā)現(xiàn)部分IHH患者呈家族聚集性,利用家系成員的遺傳背景相似性,通過顯性或隱性遺傳方式分析,比較患者與非患者的基因序列差異,有助于發(fā)現(xiàn)致病基因。本部分研究對一個罕見的家族性IHH開展了全外顯子組測序,篩選候選基因。該家系共有4名IHH女性患者,先證者是一位28歲不孕女性,表現(xiàn)為原發(fā)閉經(jīng)、低促性腺激素和低性激素水平。她的3位同胞姐姐具有相同的癥狀,確診為IHH。而其他2位姐姐及2位兄弟具有正常的性激素及促性腺激素水平,均已正常生育。我們采集了先證者及其母親、兄弟姐妹的血樣及相關(guān)的臨床資料,借助全外顯子組技術(shù)進行了候選基因的初步篩選。目的利用全外顯子組測序技術(shù),篩查家族性IHH的致病基因,并闡明作用機制。方法繪制系譜圖,同期募集的200名健康男性和200例健康女性作為正常對照。將家系中的4位IHH患者及其母親的基因組DNA進行全基因組外顯子測序,測序使用Hiseq2000平臺進行,測序長度2x100bp,利用truseq enrichment 68m捕獲芯片進行人外顯子捕獲,每個樣品測序不低于30M讀數(shù)(6G bp)的原始數(shù)據(jù)量,獲得樣品的外顯子測序數(shù)據(jù)。將測序結(jié)果進行生物信息學分析,按照常染色顯性遺傳方式篩選候選基因,符合遺傳規(guī)律的新發(fā)突變位點在家系其他成員及對照組中進行直接測序。4位IHH患者中共有而其他正常家系成員及對照中未出現(xiàn)的突變位點視為候選基因變異,進一步探討其與IHH發(fā)病的相關(guān)性。結(jié)果全外顯子組測序及后續(xù)的驗證結(jié)果顯示ADHFE1基因雜合錯義突變c.37AG(T13A)是唯一符合遺傳規(guī)律且在對照組未出現(xiàn)的新發(fā)突變位點,在家系中以常染色體顯性潰傳方式存在。該位點在物種間相對保守,且Mutation Taster預測該位點可能致病。ADHFE1基因與IHH相關(guān)性尚未見研究報道。結(jié)論首次借助全外顯子組測序技術(shù)在IHH家系中發(fā)現(xiàn)新的候選基因突變：ADHFE1基因雜合錯義突變c.37AG(T13A),首次將ADHFE1基因與IHH聯(lián)系起來。ADHFE1是否為IHH的致病基因及作用機制尚需進一步研究。第四部分特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥女性行IVF-ET助孕的妊娠結(jié)局分析目的分析特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥(idiopathic hypogonadotropic hypogonadism, IHH)女性接受體外受精一胚胎移植(IVF-ET)助孕后的妊娠結(jié)局。方法回顧性分析23例IHH患者在我院行IVF-ET助孕的卵巢反應情況及妊娠結(jié)局,以同期196例單純輸卵管性不孕接受IVF長方案助孕的女性為對照。IHH患者納入標準：原發(fā)性閉經(jīng)、基礎(chǔ)血FSH3 IU/L、孕激素撤退試驗陰性、有雌孕激素撤退出血、染色體檢查正常、顱腦影像學檢查無異常,反復促排卵指導同房未孕或合并輸卵管性不孕；單純輸卵管性不孕納入標準：雙側(cè)輸卵管梗阻且排除輸卵管積水,不合并其他不孕因素。主要分析指標：年齡,Gn總量、Gn天數(shù)、HCG日血E2水平、HCG日14mm卵泡數(shù)、HCG日子宮內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、2PN數(shù)、第3天優(yōu)胚數(shù)、妊娠率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率。采用t檢驗和×2檢驗。結(jié)果第一周期IVF結(jié)果顯示,兩組年齡分布匹配(30.48±3.82 vs 31.28±4.14歲,p0.05)。與對照組相比,病例組Gn總量顯著增多(5081.52±2372.14 vs2045.21±707.33,p0.01),超促排卵Gn天數(shù)延長(13.91±1.70 vs11.08±1.70,p0.01)。HCG日血E2水平(ng/d1)(3593.70±2331.30 vs4369.37±2288.49)、HCG日大卵泡數(shù)(9.96±3.31 vsll.31±4.57)、HCG日子宮內(nèi)膜厚度(cm)(1.12±0.15 vs1.09±0.18)、獲卵數(shù)(13.17±7.42vs13.48±5.62)、2PN數(shù)(8.09±5.12 vs 8.72±4.50)、D3優(yōu)胚數(shù)(4.48±2.92vs 4.58±2.65)均無顯著差異(p0.05)。在第一周期鮮胚移植的妊娠結(jié)局方面,IHH組妊娠率為60.87%(14/23),高于對照組50.51%(99/196)；IHH組臨床妊娠率為56.52%(13/23),高于對照組45.91%(90/196),但差異無統(tǒng)計學意義。IHH組的活產(chǎn)率略高于對照組[84.62%(11/13)vs 81.11%(73/90)],差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。截至2015年3月,23位IHH女性累積妊娠率為100%,流產(chǎn)率為13.04%(3/23)。結(jié)論相對于單純輸卵管因素不孕女性,IHH患者需要使用更多的Gn量和更長時間的超促排卵周期,但兩組的獲卵數(shù)、臨床妊娠率、活產(chǎn)率及流產(chǎn)率均無顯著差異。因此,合并其他不孕因素的IHH女性接受IVF-ET助孕后可獲得理想的妊娠結(jié)局。
【關(guān)鍵詞】：特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥(IHH) KISS1 KISS1R SNP 基因突變 IHH TACR3 基因突變 IHH ADHFE1 全基因組外顯子測序 基因突變 家族性 特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥 體外受精-胚胎移植 卵巢反應 妊娠結(jié)局
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R714.8
【目錄】：

• 中文摘要8-17
• ABSTRACT17-26
• 符號說明26-27
• 第一章、研究背景27-41
• 1.1 特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥相關(guān)基因研究進展27-33
• 1.1.1 與GnRH神經(jīng)元遷移有關(guān)的基因28-30
• 1.1.2 與GnRH分泌調(diào)節(jié)有關(guān)的基因30-32
• 1.1.3 GnRHR基因32-33
• 1.2 KISSI/KISS1R與生殖33-36
• 1.3 KNDy神經(jīng)元與GnRH脈沖釋放36-41
• 第二章 KISS1、KISS1R基因與特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥的相關(guān)性研究41-55
• 2.1 前言41-43
• 2.2 資料與方法43-50
• 2.2.1 研究對象43
• 2.2.2 臨床及生化指標檢測43-44
• 2.2.3 主要實驗試劑和儀器44-46
• 2.2.4 KISS1/KISS1R基因突變篩查46-50
• 2.3 結(jié)果50-52
• 2.3.1 臨床基本特征50-51
• 2.3.2 KISS1基因突變51-52
• 2.3.3 KISS1R基因突變52
• 2.4 討論52-54
• 2.5 結(jié)論54-55
• 第三章 TACR3基因在低促性腺激素性性腺功能減退癥中的作用及機制研究55-89
• 3.1 前言55-56
• 3.2 資料與方法56-79
• 3.2.1 研究對象56
• 3.2.2 臨床及生化指標檢測56-57
• 3.2.3 主要實驗試劑和儀器57-61
• 3.2.4 TACR3基因突變篩查61-65
• 3.2.5 體外功能實驗65-79
• 3.2.6 統(tǒng)計學分析79
• 3.3 結(jié)果79-85
• 3.3.1 TACR3基因突變79-81
• 3.3.2 功能預測81
• 3.3.3 細胞轉(zhuǎn)染后圖像81-82
• 3.3.4 Fura-2/AM檢測細胞內(nèi)游離鈣離子濃度實驗結(jié)果82-83
• 3.3.5 NFAT測鈣實驗結(jié)果83-85
• 3.4 討論85-88
• 3.5 結(jié)論88-89
• 第四章 家族性低促性腺激素性性腺功能減退癥的致病基因篩查89-96
• 4.1 前言89
• 4.2 資料與方法89-91
• 4.2.1 研究對象89-90
• 4.2.2 臨床及生化指標檢測90
• 4.2.3 系譜圖的繪制90
• 4.2.4 全基因組外顯子測序及結(jié)果的驗證90-91
• 4.3 結(jié)果91-94
• 4.3.1 系譜圖91-93
• 4.3.2 測序結(jié)果93
• 4.3.3 功能預測93-94
• 4.4 討論94-95
• 4.5 結(jié)論95-96
• 第五章 特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥女性行IVF-ET助孕的妊娠結(jié)局分析96-103
• 5.1 前言96
• 5.2 材料和方法96-98
• 5.2.1 病例選擇與分組96-97
• 5.2.2 超促排卵方案97-98
• 5.2.3 扳機及黃體支持治療98
• 5.2.4 統(tǒng)計分析98
• 5.3 結(jié)果98-100
• 5.4 討論100-102
• 5.5 結(jié)論102-103
• 參考文獻103-126
• 致謝126-127
• 攻讀博士學位期間發(fā)表和待發(fā)表的學術(shù)論文127-128
• 學位論文評閱及答辯情況表128-129
• 英文論文一129-140
• 英文論文二140-149

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本文編號：443403