發(fā)布時間：2023-05-19 02:53

　　目的和意義肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)生率和致死率在全世界惡性腫瘤中都名列前茅。早期生長反應(yīng)因子1(early growth response factor 1,Egr1)在多種腫瘤病理進(jìn)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。但Egr1在HCC中的作用及機(jī)制尚不明確。研究證實多種microRNA(miRNA)參與HCC的調(diào)控,但尚缺乏靶向作用Egr1調(diào)控HCC的研究。本課題擬通過體內(nèi)體外實驗,探討Egr1在HCC細(xì)胞增殖中的作用和機(jī)制及靶向調(diào)控Egr1基因的上游miRNA,為深入理解HCC的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點奠定理論基礎(chǔ)。研究方法在人類蛋白質(zhì)圖譜相關(guān)網(wǎng)站查詢Egr1、TGF-β1在人HCC中的表達(dá)情況后,選取2015-2016年經(jīng)術(shù)后病理確診的20對人HCC及癌旁標(biāo)本,qRT-PCR和Western b1ot檢測標(biāo)本中Egr1、TGF-β1基因的mRNA和蛋白表達(dá)。選取人HCC細(xì)胞株HepG2和Hep3B進(jìn)行細(xì)胞實驗。通過瞬時轉(zhuǎn)染改變細(xì)胞內(nèi)Egr1的表達(dá),qRT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Egr1、TGF-β1基因的mRNA和蛋...

【文章頁數(shù)】：125 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
第1章 Egr1和TGF-β1基因在臨床HCC組織標(biāo)本中表達(dá)
    1.1 實驗材料及儀器
        1.1.1 實驗材料
        1.1.2 主要試劑配制
        1.1.3 實驗儀器
    1.2 實驗方法及步驟
        1.2.1 人類蛋白質(zhì)圖譜上的查詢Egr1及TGF-β1免疫組化染色
        1.2.2 實驗分組
        1.2.3 實時熒光定量PCR(臨床組織標(biāo)本)
        1.2.4 免疫印跡法(臨床組織標(biāo)本)
        1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法
    1.3 實驗結(jié)果
        1.3.1 人類蛋白質(zhì)圖譜中Egr1和TGF-β1在HCC的免疫組化染色
        1.3.2 臨床HCC及癌旁的組織標(biāo)本中Egr1和TGF-β 1基因表達(dá)情況
    1.4 討論
第2章 Egr1基因?qū)CC細(xì)胞增殖功能的影響
    2.1 實驗材料及儀器
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 主要試劑配制
        2.1.3 實驗儀器
    2.2 實驗方法及步驟
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.2 細(xì)胞計數(shù)與種板
        2.2.3 質(zhì)粒擴(kuò)增、提取及檢測
        2.2.4 同步化處理與實驗分組
        2.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        2.2.6 實時熒光定量PCR(細(xì)胞)
        2.2.7 免疫印跡法(細(xì)胞)
        2.2.8 CCK-8法測定細(xì)胞增殖
        2.2.9 統(tǒng)計學(xué)方法
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 轉(zhuǎn)染pENTER-Egr1質(zhì)粒DNA的HepG2和Hep3B細(xì)胞中Egr1和TGF-β1的表達(dá)情況
        2.3.2 轉(zhuǎn)染pENTER-Egr1質(zhì)粒DNA的HepG2和Hep3B細(xì)胞增殖情況
        2.3.3 轉(zhuǎn)染siEgr1的HepG2和Hep3B細(xì)胞中Egr1和TGF-β1基因的表達(dá)情況
        2.3.4 轉(zhuǎn)染siEgr1沉默Egr1表達(dá)的HepG2和Hep3B細(xì)胞增殖情況
    2.4 討論
第3章 HCC細(xì)胞中Egr1基因?qū)GF-β1/Smad信號通路的調(diào)控作用
    3.1 實驗材料及儀器
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 主要試劑配制
    3.2 實驗方法及步驟
        3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.2 細(xì)胞計數(shù)與種板
        3.2.3 質(zhì)粒擴(kuò)增、提取及檢測
        3.2.4 同步化處理與實驗分組
        3.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.2.6 免疫印跡法(細(xì)胞)
        3.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 HCC細(xì)胞過表達(dá)Egr1基因?qū)GF-β1/Smad信號通路的影響
        3.3.2 HCC細(xì)胞沉默Egr1的表達(dá)對TGF-β1/Smad信號通路的影響
    3.4 討論
第4章 HCC細(xì)胞中miR-181a-5p靶向抑制Egr1基因的表達(dá)
    4.1 實驗材料及儀器
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 主要試劑配制
        4.1.3 實驗儀器
    4.2 實驗方法及步驟
        4.2.1 預(yù)測與Egr1 mRNA結(jié)合的miRNAs
        4.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.3 細(xì)胞計數(shù)與種板
        4.2.4 同步化處理與實驗分組
        4.2.5 實時熒光定量PCR(細(xì)胞)
        4.2.6 雙熒光素酶報告基因
        4.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 靶向調(diào)節(jié)Egr1基因的miRNA的篩選
        4.3.2 臨床HCC組織標(biāo)本中miR-181a-5p的表達(dá)及與Egr1基因表達(dá)的相關(guān)性分析
        4.3.3 Egr1基因3'UTR載體的構(gòu)建
        4.3.4 雙螢光素酶報告基因檢測
    4.4 討論
第5章 MiR-181a-5p抑制Egr1/TGF-β信號通路延緩HCC細(xì)胞增殖的研究
    5.1 實驗材料及儀器
        5.1.1 實驗材料
        5.1.2 主要試劑配制
        5.1.3 實驗儀器
    5.2 實驗方法及步驟
        5.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        5.2.2 細(xì)胞計數(shù)與種板
        5.2.3 同步化處理
        5.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        5.2.5 實時熒光定量PCR(細(xì)胞)
        5.2.6 免疫印跡法(細(xì)胞)
        5.2.7 CCK-8法測定細(xì)胞增殖
        5.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 HCC細(xì)胞miR-181a-5p表達(dá)下調(diào)對Egr1、TGF-β基因的表達(dá)的影響
        5.3.2 HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181a-5p inhibitor對細(xì)胞增殖功能的影響
        5.3.3 HCC細(xì)胞miR-181a-5p表達(dá)上調(diào)對Egr1、TGF-β基因的表達(dá)的影響
        5.3.4 HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics對細(xì)胞增殖功能的影響
    5.4 討論
第6章 MiR-181a-5p靶向調(diào)節(jié)Egr1基因的表達(dá)介導(dǎo)HCC細(xì)胞增殖的研究
    6.1 實驗材料及儀器
        6.1.1 實驗材料
        6.1.2 主要試劑配制
        6.1.3 實驗儀器
    6.2 實驗方法及步驟
        6.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        6.2.2 細(xì)胞計數(shù)與種板
        6.2.3 同步化處理及實驗分組
        6.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        6.2.5 實時熒光定量PCR(細(xì)胞)
        6.2.6 免疫印跡法(細(xì)胞)
        6.2.7 CCK-8法測定細(xì)胞增殖
        6.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法
    6.3 實驗結(jié)果
        6.3.1 miR-181a-5p inhibitor與siEgr1共轉(zhuǎn)后對HepG2和Hep3B細(xì)胞Egr1、TGF-β1基因表達(dá)的影響
        6.3.2 miR-181a-5p inhibitor與siEgr1共轉(zhuǎn)后對HepG2和Hep3B細(xì)胞增殖功能的影響
    6.4 討論
參考文獻(xiàn)
英文縮略詞
全文小結(jié)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文
致謝



本文編號：3819514