發(fā)布時(shí)間：2023-03-20 02:48

　　目的:在我國,胃癌的發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤的第2位,嚴(yán)重威脅著人們的生命健康,且發(fā)病率無明顯下降趨勢(shì)。絕大多數(shù)胃癌起病隱匿,早期并無明顯的臨床癥狀,或出現(xiàn)非特異性癥狀(如惡心、噯氣、食欲缺乏及上腹不適等)而被忽略,所以胃癌的早期診斷率仍較低,大多數(shù)患者在就醫(yī)時(shí)往往已經(jīng)錯(cuò)過治療的最佳時(shí)期。雖然以胃癌D2根治術(shù)為基礎(chǔ)的腫瘤規(guī)范化治療正在被廣泛推廣應(yīng)用,但我國胃癌患者的5年生存率仍然只有50%左右。Borrmann 4型胃癌被認(rèn)為是最特殊的一類胃癌,又稱彌漫型癌,它與一般胃癌不同,Borrmann 4型胃癌往往生長較為迅速,可以很快便向整個(gè)腹腔播散轉(zhuǎn)移,初診時(shí)往往即有腹膜播散。所以Borrmann 4型胃癌手術(shù)切除率低,而且實(shí)行根治手術(shù)后腹膜復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移多見,預(yù)后較其他Borrmann分型胃癌差。因此,深入研究Borrmann4型胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,尋找關(guān)鍵生物標(biāo)志物和良好的治療靶點(diǎn)對(duì)于預(yù)防和治療Borrmann 4型胃癌有重要意義。鞘氨醇-1-磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(Spinster homolog 2,SPNS2)是SPNS/Spinster家族成員之一,是一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其可以利用物質(zhì)在細(xì)胞膜內(nèi)外...

【文章頁數(shù)】：124 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分:高通量測(cè)序技術(shù)初步篩查Borrmann4 型胃癌研究的候選基因及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫初步驗(yàn)證、分析
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 主要試劑配制
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.2 細(xì)胞系STR鑒定
            2.2.3 高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
            2.2.4 數(shù)據(jù)分析
            2.2.5 利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫在線分析工具分析候選基因
            2.2.6 總RNA抽提
            2.2.7 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA
            2.2.8 Real-time PCR檢測(cè)
            2.2.9 數(shù)據(jù)分析
            2.2.10 細(xì)胞蛋白樣本的提取
            2.2.11 BCA法測(cè)定蛋白濃度
            2.2.12 SDS-PAGE電泳
            2.2.13 濕法免疫印跡雜交
            2.2.14 顯影
    3 結(jié)果
        3.1 OCUM-1 細(xì)胞系和AGS細(xì)胞系STR鑒定結(jié)果
        3.2 高通量測(cè)序分析結(jié)果
            3.2.1 測(cè)序質(zhì)控
            3.2.2 比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)
            3.2.3 基因和轉(zhuǎn)錄本表達(dá)定量分析
            3.2.4 樣本相關(guān)性分析
            3.2.5 差異表達(dá)基因聚類分析
            3.2.6 差異表達(dá)基因散點(diǎn)圖
            3.2.7 差異表達(dá)基因GO分析
            3.2.8 差異表達(dá)基因Pathway分析
            3.2.9 初步篩選出要研究的候選基因
            3.2.10 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫在線分析工具初步分析候選基因
            3.2.11 Real-time PCR法檢測(cè)人胃癌細(xì)胞系及人正常胃粘膜細(xì)胞系中4 個(gè)候選基因的mRNA含量錯(cuò)誤
            3.2.12 Western Blot檢測(cè)在不同分化程度胃癌細(xì)胞系和正常胃粘膜細(xì)胞系中2個(gè)候選基因的蛋白表達(dá)水平
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分:SPNS2在Borrmann4 型胃癌的表達(dá)及預(yù)后意義
    6 前言
    7 材料和方法
        7.1 主要試劑和儀器
            7.1.1 主要試劑
            7.1.2 主要儀器
        7.2 實(shí)驗(yàn)方法
            7.2.1 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫在線分析工具 Kaplan-Meier plotter 分析
            7.2.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象和分組
            7.2.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)—脫蠟水化
            7.2.4 免疫組化實(shí)驗(yàn)—滅活內(nèi)源性過氧化物酶
            7.2.5 免疫組化實(shí)驗(yàn)—熱抗原修復(fù)
            7.2.6 免疫組化染色
            7.2.7 免疫組化評(píng)分
            7.2.8 免疫組化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析
    8 結(jié)果
        8.1 Kaplan Meier-plotter分析結(jié)果
        8.2 SPNS2 在胃癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)差異
        8.3 SPNS2在Borrmann4 型胃癌組織與其它Borrmann類型胃癌組織的表達(dá)差異
        8.4 SPNS2 表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系
        8.5 SPNS2 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系
        8.6 SPNS2 表達(dá)與Borrmann4 型胃癌病例的臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系
        8.7 SPNS2 表達(dá)與Borrmann4 型胃癌病例預(yù)后的關(guān)系
    9 討論
    10 結(jié)論
第三部分:SPNS2對(duì)Borrmann4 型胃癌生物學(xué)行為的調(diào)控作用及機(jī)制
    11 前言
    12 材料和方法
        12.1 主要試劑和儀器
            12.1.1 主要試劑
            12.1.2 主要儀器
            12.1.3 主要試劑配制
        12.2 實(shí)驗(yàn)方法
            12.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            12.2.2 SPNS2 敲減病毒感染人胃癌細(xì)胞系OCUM-1
            12.2.3 細(xì)胞總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄,QT-PCR檢測(cè)不同設(shè)計(jì)靶點(diǎn)慢病毒轉(zhuǎn)染敲減SPNS2 后的表達(dá),判斷慢病毒轉(zhuǎn)染后敲減SPNS2 的效率
            12.2.4 Western Blot檢測(cè)蛋白水平慢病毒轉(zhuǎn)染后敲減SPNS2 的效率
            12.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)
            12.2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
            12.2.7 細(xì)胞增殖與活力實(shí)驗(yàn)(CCK8)法
            12.2.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期
            12.2.9 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡(Annexin V-FITC雙染法)
            12.2.10 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)mRNA水平
            12.2.11 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá)
            12.2.12 統(tǒng)計(jì)分析
    13 結(jié)果
        13.1 穩(wěn)定低表達(dá)SPNS2的OCUM-1 細(xì)胞系的建立
        13.2 敲減內(nèi)源性SPNS2 表達(dá)抑制OCUM-1 的侵襲能力
        13.3 敲減內(nèi)源性SPNS2 表達(dá)抑制OCUM-1 的遷移能力
        13.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)評(píng)估敲減內(nèi)源性SPNS2 表達(dá)對(duì)OCUM-1 增殖能力的影響..
        13.5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)評(píng)估敲減內(nèi)源性SPNS2 表達(dá)對(duì)OCUM-1細(xì)胞周期的影響
        13.6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)評(píng)估敲減內(nèi)源性SPNS2 表達(dá)對(duì)OCUM-1凋亡的影響
        13.7 敲減內(nèi)源性SPNS2 表達(dá)后OCUM-1 細(xì)胞EMT相關(guān)因子及侵襲相關(guān)因子的mRNA含量變化
        13.8 敲減內(nèi)源性SPNS2 表達(dá)后OCUM-1 細(xì)胞PI3K/AKT通路相關(guān)因子的mRNA含量變化
        13.9 敲減內(nèi)源性SPNS2 表達(dá)后OCUM-1 細(xì)胞EMT相關(guān)因子及侵襲相關(guān)因子的蛋白表達(dá)變化
        13.10 敲減內(nèi)源性SPNS2 表達(dá)后OCUM-1 細(xì)胞PI3K/AKT通路相關(guān)因子的蛋白表達(dá)變化
    14 討論
    15 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià)
參考文獻(xiàn)
綜述 鞘氨醇-1-磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體研究現(xiàn)狀
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3766530