本文關鍵詞：巴弗洛霉素A1實驗治療兒童B-急性淋巴細胞白血病，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)是最常見的兒童白血病。目前兒童B細胞急性淋巴細胞白血病的治療方案往往與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的副作用和復發(fā)有關。因此,需要更有效、更安全的藥物。Bafilomycin A1(Baf-Al)是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,已用于臨床治療索氏梭菌引起的敗血癥,但尚未見于實體瘤的臨床治療應用,也未見于白血病的治療研究。本課題旨在研究Baf:Al對B-ALL的實驗治療作用,并探討其作用機制,為其研發(fā)成為B-ALL靶向治療新藥提供臨床前實驗研究數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。具體目標：(1)明確Baf-Al對B-ALL細胞的特異性殺傷作用；(2)確定Baf-A1對B-ALL動物模型的治療作用；(3)明確Baf-Al靶向B-ALL患者原代細胞的臨床意義；(4)探索Baf-A1實驗治療B-ALL的分子機制。方法：首先,通過CCK8檢測Baf-Al對B-ALL細胞生長的影響,流式CFSE檢測對細胞增殖的影響,流式PI檢測對細胞周期的影響,流式PI/AnnexinV雙染檢測對細胞凋亡的影響等,確定體外細胞水平Baf-Al 對B.ALL的抑制作用.其次,通過CCK8檢測Baf-Al對B-AL L患者原代細胞生長的影響,以及流式PI/AnnexinV雙染檢測對患者原代細胞凋亡的影響,確定Baf-Al抑制B-ALL的臨床意義。然后,建立B-ALL小鼠模型。4周齡雄性NOD/SCID小鼠飼養(yǎng)于SPF動物房。將處于指數(shù)生長期的標記了GFP的697細胞(5-10×106個細胞/0.2 m1)經(jīng)尾靜脈注射到NOD/SCID小鼠體內(nèi)。觀察小鼠體重、飲食和活動性等情況變化,第四周處死N OD/SCID小、鼠。B-ALL小鼠模型成功建立的評定標準：a)體重、活動量、飲食水量下降；b)出現(xiàn)肢體癱瘓小鼠；c)外周血、骨髓中白細胞數(shù)量和比率升高,血涂片可見大量幼稚細胞；d)肝、脾、胃等組織有大量白細胞浸潤；e)血液和骨髓中能檢測出E2A/Pbx1融合基因表達。在成功建�；A上,研究Baf-A1對B-ALL小鼠的治療效果。NOD/SCID小鼠分為四組：對照組(C)、發(fā)病組(M)、治療組1(T1)和治療組2(T2)。治療組注射697細胞一周后再注射Baf-A1。其中,治療組1：NOD/SCID小鼠腹腔注射0.1 mg/kg Baf-Al.治療組2：NOD/SCID小鼠腹腔注射1 mg/kg Baf-Al。同時,對照組和發(fā)病組：NOD/SCID小鼠注射生理鹽水。所有各組均每天一次,連續(xù)3天給藥。治療效果的評定標準：a)延長小鼠生存時間；b)降低出現(xiàn)肢體癱瘓小鼠的比率；c)緩解白血病細胞對組織的浸潤；d)外周血象、骨髓象恢復。此外,我們使用C57BL/6J小鼠為模型初步進行了毒力測定。將小鼠分為6組,分別給予注射不同濃度的Baf-A1:0.1、1、5、10、25mg/kg,同時將1組設為對照組給予注射相應劑量的乙醇(Baf-Al的溶劑)。注射兩周后沒有小鼠發(fā)生死亡。每隔一天稱量一次體重。在注射Baf-Al后的第14天將小鼠全部處死,取外周血細胞做血象分析,取各組織做比重分析,取肝組織做病理觀察。進而,我們通過免疫印跡、成像流式分析、共聚焦成像、siRNA干擾等實驗手段,初步探索了Baf-A1特異性殺傷B-ALL細胞的分子機制。結果：一、Baf-Al特異性抑制B-ALL細胞系增殖,而對髓系白血病細胞和正常骨髓細胞的生長和活性沒有明顯影響。對白血病小鼠模型的研究表明,Baf-A1可以有效治療B-ALL,降低死亡率,減弱白血病細胞對肝、脾的浸潤。C57小鼠體內(nèi)毒性試驗表明,治療劑量下的Baf-A1是安全的。Baf-A1的選擇性殺傷作用在B-ALL患者原代細胞上也獲得證實。二、Baf-Al是H+-ATPase酶的抑制劑,在高濃度下,常用于抑制晚期自噬。在本課題研究中,我們首次發(fā)現(xiàn)Baf-A1在低濃度(1 nM)下除了能夠通過抑制自噬體和溶酶體的融合從而抑制晚期自噬之外,還能通過激活mTOR信號通路,并通過干擾Beclin 1-Vps34復合體的形成,抑制早期自噬途徑。三、Baf-Al通過改變線粒體的膜勢能,使位于線粒體膜間隙的AIF變成可溶性的蛋白,釋放到胞漿,然后入核,最終誘導了caspase非依賴型的細胞凋亡。此外,Ba f-Al誘導Beclinl-Bcl-2復合體的增多,進一步抑制細胞自噬和誘導細胞凋亡。結論：Baf-Al能特異、高效地殺傷體內(nèi)外的B-急性淋巴白血病細胞,對正常細胞無毒副作用,因此,Baf-A1可望應用于白血病治療的臨床試驗。
【關鍵詞】：B急性淋巴細胞白血病(B-ALL) 巴弗洛霉素Al(Baf-Al) 自噬 凋亡
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.71
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 前言12-18
• 第一部分：巴弗洛霉素A1靶向B-急性淋巴細胞白血病的作用研究18-40
• 1 材料與方法18-23
• 2 結果23-38
• 2.1 Baf-A1體外特異性抑制B-ALL細胞的生長23-25
• 2.2 Baf-A1特異性抑制B-ALL病人原代細胞的生長25-27
• 2.3 Baf-A1對人白血病細胞異種移植小鼠模型有明顯的治療作用27-34
• 2.4 毒力測定實驗表明在治療劑量下Baf-A1無毒副作用34-38
• 3 討論38-40
• 第二部分：巴弗洛霉素A1靶向B-急性淋巴細胞白血病的機制研究40-71
• 1 材料與方法40-48
• 2 結果48-68
• 2.1 Baf-A1減緩B-ALL細胞周期進程48-51
• 2.2 Baf-A1通過多靶點有效抑制B-ALL細胞的自噬51-58
• 2.3 Baf-A1通過AIF介導的非經(jīng)典凋亡通路誘導B-ALL細胞的凋亡58-68
• 3 討論68-71
• 結論71-72
• 參考文獻72-81
• 綜述81-109
• 參考文獻98-109
• 博士學位期間公開發(fā)表的論文109-110
• 附錄110-111
• 中英文縮略詞匯表111-113
• 致謝113

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