研究背景和目的:多靶點(diǎn)、多激酶抑制劑索拉非尼是第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)用于晚期肝癌患者治療的靶向藥物,但是索拉非尼耐藥是導(dǎo)致晚期肝癌患者預(yù)后不良的主要原因。自噬（autophagy）是不同于凋亡的一種細(xì)胞死亡編程,大量的研究證實(shí)細(xì)胞自噬的發(fā)生與腫瘤的藥物敏感性密切相關(guān)。最近大量的研究證實(shí)蛋白質(zhì)翻譯后修飾是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的關(guān)鍵步驟,是蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡和相互作用的重要分子基礎(chǔ),幾乎參與了細(xì)胞所有的生理活動(dòng)過程。類泛素蛋白FAT10（Human HLA-F adjacent transcript 10）目前認(rèn)為是蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程中最重要的蛋白之一。研究表明FAT10在多種惡性腫瘤的的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵的作用,我們前期大量的研究證實(shí)FAT10在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá),降低FAT10的表達(dá)可以顯著抑制肝癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移,然而FAT10和自噬在肝癌索拉非尼耐藥中的關(guān)系以及FAT10與自噬的關(guān)系尚不清楚。本研究擬先通過構(gòu)建索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞株觀察FAT10對(duì)索拉非尼耐藥的關(guān)系;其次通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)明確FAT10是否調(diào)控自噬進(jìn)而影響肝癌的索拉非尼耐藥;最后探索FAT10調(diào)控自噬的具體分子生物學(xué)機(jī)... 

【文章頁(yè)數(shù)】：104 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
中英文縮略詞表
前言
第1章 FAT10 對(duì)肝癌細(xì)胞索拉非尼耐藥的影響
    1 引言
    2 材料
        2.1 細(xì)胞系
        2.2 主要試劑
        2.3 自配試劑
        2.4 主要儀器設(shè)備
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2 提取細(xì)胞總RNA及熒光定量PCR
        3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
        3.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
        3.5 組織免疫熒光
        3.6 免疫組化
        3.7 細(xì)胞蛋白提取及蛋白免疫印跡反應(yīng)(Western blot)
        3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4 結(jié)果
        4.1 構(gòu)建索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞株
        4.2 觀察索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞株中FAT10 表達(dá)的變化
        4.3 體外實(shí)驗(yàn)觀察降低FAT10 對(duì)肝癌細(xì)胞索拉非尼敏感性的影響
        4.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察FAT10 對(duì)肝癌細(xì)胞索拉非尼耐藥的影響
    5 結(jié)論
    6 討論
第2章 FAT10 通過PTEN/AKT信號(hào)通路調(diào)控自噬影響肝癌細(xì)胞索拉非尼敏感性
    1 引言
    第1節(jié) FAT10 通過調(diào)控自噬影響肝癌細(xì)胞索拉非尼敏感性
        2 材料
            2.1 細(xì)胞系
            2.2 主要試劑
            2.3 自配試劑
            2.4 主要儀器設(shè)備
        3 實(shí)驗(yàn)方法
            3.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建
            3.2 細(xì)胞免疫熒光
            3.3 免疫組化
            3.4 蛋白免疫印跡反應(yīng)(Western blot)
            3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        4 結(jié)果
            4.1 索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞自噬水平的變化
            4.2 體外實(shí)驗(yàn)觀察降低FAT10 觀察索拉非尼耐藥肝癌細(xì)胞自噬水平的變化
            4.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察降低FAT10 觀察索拉非尼耐藥肝癌細(xì)胞自噬水平的變化
            4.4 FAT10 通過調(diào)控索拉非尼耐藥細(xì)胞自噬水平影響索拉非尼耐藥性
        5 結(jié)論
    第2節(jié) FAT10 通過PTEN/AKT信號(hào)通路調(diào)控自噬
        2 材料
            2.1 細(xì)胞系
            2.2 主要試劑
            2.3 自配試劑
            2.4 主要儀器設(shè)備
        3 實(shí)驗(yàn)方法
            3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            3.2 蛋白免疫印跡反應(yīng)(Western blot)
            3.3 細(xì)胞免疫熒光
            3.4 統(tǒng)計(jì)分析
        4 結(jié)果
            4.1 索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞自噬相關(guān)信號(hào)通路PTEN/AKT的變化
            4.2 在索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞中FAT10 調(diào)控PTEN/AKT信號(hào)通路
            4.3 PTEN/AKT信號(hào)通路是FAT10 激活自噬的關(guān)鍵信號(hào)通路
        5 結(jié)論
        6 討論
第3章 FAT10 通過穩(wěn)定NEDD4 激活PTEN/AKT信號(hào)通路促進(jìn)自噬導(dǎo)致肝癌細(xì)胞索拉非尼耐藥
    1 引言
    第1節(jié) FAT10 通過NEDD4 激活PTEN/AKT信號(hào)通路
        2 材料
            2.1 細(xì)胞系
            2.2 主要試劑
            2.3 自配試劑
            2.4 主要儀器設(shè)備
        3 實(shí)驗(yàn)方法
            3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            3.2 蛋白免疫印跡反應(yīng)(Western blot)
            3.3 細(xì)胞免疫熒光
            3.4 免疫共沉淀(Co-IP)
        4 結(jié)果
            4.1 FAT10 蛋白與PTEN蛋白不存在結(jié)合
            4.2 FAT10 蛋白與NEDD4 蛋白存在結(jié)合
            4.3 FAT10 通過NEDD4 調(diào)控PTEN/AKT信號(hào)通路進(jìn)而激活自噬
            4.4 NEDD4是FAT10 調(diào)控PTEN/AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白
        5 結(jié)論
    第2節(jié) FAT10 通過穩(wěn)定NEDD4 的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)PTEN泛素化降解
        2 材料
            2.1 細(xì)胞系
            2.2 主要試劑
            2.3 自配試劑
            2.4 主要儀器設(shè)備
        3 實(shí)驗(yàn)方法
            3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            3.2 蛋白免疫印跡反應(yīng)(Western blot)
            3.3 免疫共沉淀(Co-IP)
            3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        4 結(jié)果
            4.1 在HepG2-Sorafenib Resistant細(xì)胞中降低FAT10 促進(jìn)NEDD4 的泛素化降解
            4.2 在Huh7-Sorafenib Resistant細(xì)胞中降低FAT10 促進(jìn)NEDD4 的泛素化降解
            4.3 FAT10 通過調(diào)控NEDD4 的蛋白酶體使其降解
            4.4 FAT10 抑制NEDD4 的泛素化水平
        5 結(jié)論
        6 討論
全文總結(jié)
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間的研究成果
綜述
    參考文獻(xiàn)



本文編號(hào)：3710787