葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中保守的分子伴侶,能夠幫助新生蛋白質(zhì)正確折疊和組裝,而且也是一種重要的鈣調(diào)蛋白,能夠結(jié)合Ca²⁺,調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)。研究表明,腫瘤缺氧、缺糖、酸性的微環(huán)境會(huì)刺激GRP78發(fā)生高表達(dá)。高表達(dá)的GRP78會(huì)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逃逸到線粒體、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表面等促進(jìn)腫瘤進(jìn)程。更重要的是,GRP78可以被分泌到胞外,通過(guò)改造微環(huán)境促進(jìn)腫瘤發(fā)展。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是腫瘤微環(huán)境中數(shù)目最多的一類免疫細(xì)胞,TAMs能夠分泌細(xì)胞因子、趨化因子等為腫瘤的生長(zhǎng)和存活提供有利條件,而分泌型GRP78能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中多種間質(zhì)細(xì)胞,改造微環(huán)境,促進(jìn)腫瘤發(fā)展,表明二者在微環(huán)境中發(fā)揮“促腫瘤”的功能上具有相似之處;TAMs受各種趨化因子、細(xì)胞因子等的招募常常聚集于腫瘤的缺氧部位,而腫瘤組織中心缺氧的微環(huán)境會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GRP78的高表達(dá),表明二者在定位上有相似之處;TAMs大量出現(xiàn)在腫瘤發(fā)展的中后期,而GRP78的表達(dá)也與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān),因此二者在出現(xiàn)的時(shí)間上也具有一定的相似之處。基于上述GRP78與巨噬細(xì)胞在功能、定位和出現(xiàn)的時(shí)間上的相似之... 

【文章來(lái)源】：山西大學(xué)山西省

【文章頁(yè)數(shù)】：164 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 引言
    2 腫瘤微環(huán)境與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞
        2.1 腫瘤微環(huán)境的提出及其組成
        2.2 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的起源
        2.3 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在微環(huán)境中的作用
            2.3.1 TAMs在血管生成中的作用
            2.3.2 TAMs在淋巴管生成中的作用
            2.3.3 TAMs在免疫抑制中的作用
            2.3.4 TAMs在胞外基質(zhì)重塑中的作用
            2.3.5 TAMs在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用
        2.4 TAMs浸潤(rùn)到腫瘤組織的誘導(dǎo)因素
            2.4.1 趨化因子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子的刺激
            2.4.2 低氧的刺激
        2.5 細(xì)胞定向遷移的分子機(jī)制
            2.5.1 鈣信號(hào)
            2.5.2 骨架重塑與Rho家族成員的調(diào)控機(jī)制
    3 GRP78 與腫瘤
        3.1 GRP78 的基本結(jié)構(gòu)和功能
        3.2 腫瘤分泌型GRP78 的功能
        3.3 分泌型蛋白質(zhì)進(jìn)入真核細(xì)胞的途徑
            3.3.1 吞噬作用(Phagocytosis)
            3.3.2 胞飲作用(Pinocytosis)
    4 靶向GRP78 的腫瘤干預(yù)策略
    5 本課題的研究意義及研究?jī)?nèi)容
第二章 分泌型GRP78 能夠招募巨噬細(xì)胞到腫瘤組織
    1 引言
    2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)試劑、材料及儀器設(shè)備
            2.1.1 試劑及抗體
            2.1.2 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞系
            2.1.3 小鼠和病人血液樣品
            2.1.4 明膠酶譜實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑的配制
            2.1.5 儀器設(shè)備
        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及腫瘤細(xì)胞/巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基的收集
            2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.2 細(xì)胞傳代
            2.2.3 細(xì)胞凍存
            2.2.4 細(xì)胞復(fù)蘇
            2.2.5 腫瘤細(xì)胞/巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基的收集
        2.3 ELISA檢測(cè)
        2.4 pET-28a-GRP78 質(zhì)粒構(gòu)建、蛋白表達(dá)純化、內(nèi)毒素的去除
            2.4.1 pET-28a-GRP78 質(zhì)粒構(gòu)建
            2.4.2 His-GRP78 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
            2.4.3 His-GRP78 蛋白的純化
            2.4.4 His-GRP78 蛋白內(nèi)毒素的去除
        2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
            2.5.1 細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)
            2.5.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
            2.5.3 體外RAW264.7 細(xì)胞定向遷移實(shí)驗(yàn)
        2.6 細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附實(shí)驗(yàn)
        2.7 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
            2.7.1 裸鼠荷瘤模型
            2.7.2 基質(zhì)膠模型
        2.8 Western blot實(shí)驗(yàn)
        2.9 明膠酶譜實(shí)驗(yàn)
        2.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)
            2.10.1 細(xì)胞總RNA的提取
            2.10.2 細(xì)胞總RNA的反轉(zhuǎn)錄
            2.10.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        2.11 免疫熒光染色
        2.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 GRP78 的分泌量和腫瘤惡性程度呈正相關(guān)
        3.2 GRP78 的分泌量與腫瘤的促巨噬細(xì)胞遷移能力呈正相關(guān)
        3.3 腫瘤分泌型GRP78 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移
        3.4 腫瘤分泌型GRP78 能夠在體外招募RAW264.7 細(xì)胞
        3.5 分泌型GRP78 在體內(nèi)能夠招募巨噬細(xì)胞
        3.6 Fibronectin-integrin-β1-FAK信號(hào)介導(dǎo)了分泌型GRP78 在巨噬細(xì)胞與基質(zhì)之間的促粘附作用
        3.7 分泌型GRP78 促進(jìn)了巨噬細(xì)胞胞外基質(zhì)的降解
    4 討論
    5 小結(jié)
第三章 分泌型GRP78 通過(guò)多種胞吞方式的協(xié)同作用進(jìn)入巨噬細(xì)胞
    1 引言
    2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料
            2.1.1 試劑及抗體
            2.1.2 細(xì)胞系和質(zhì)粒
            2.1.3 試劑配方
        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3 His-GRP78 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)純化與FITC-/Biotin-標(biāo)記
        2.4 His-GRP78 蛋白的內(nèi)化實(shí)驗(yàn)
            2.4.1 抗體檢測(cè)His-GRP78 的內(nèi)化情況
            2.4.2 熒光標(biāo)記His-GRP78 檢測(cè)其內(nèi)化情況
            2.4.3 能量缺失情況下檢測(cè)His-GRP78 蛋白內(nèi)化情況
            2.4.4 M期阻滯情況下檢測(cè)His-GRP78 蛋白內(nèi)化情況
            2.4.5 使用內(nèi)吞抑制劑檢測(cè)His-GRP78 蛋白內(nèi)化情況
        2.5 質(zhì)譜鑒定分泌型GRP78 的受體
        2.6 siRNA轉(zhuǎn)染
        2.7 Western blot和免疫共沉淀(Co-IP)
        2.8 免疫熒光染色
        2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 His-GRP78 能夠進(jìn)入RAW264.7 細(xì)胞
        3.2 His-GRP78 能夠通過(guò)胞吞作用進(jìn)入RAW264.7 細(xì)胞
        3.3 吞噬作用有助于分泌型GRP78 進(jìn)入巨噬細(xì)胞
        3.4 分泌型GRP78 的內(nèi)化依賴于巨胞飲作用
        3.5 網(wǎng)格蛋白和窖蛋白介導(dǎo)的胞吞作用可能也是分泌型GRP78 進(jìn)入巨噬細(xì)胞的途徑
        3.6 Clathrin和 Caveolin-1 介導(dǎo)的胞吞作用是分泌型GRP78 進(jìn)入巨噬細(xì)胞的重要途徑
        3.7 Ajuba受體介導(dǎo)了分泌型GRP78 的內(nèi)化作用
        3.8 內(nèi)化的GRP78 定位于巨噬細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體
    4 討論
    5 小結(jié)
第四章 分泌型GRP78 能夠通過(guò)與Ca~(2+)結(jié)合促進(jìn)巨噬細(xì)胞的骨架重塑
    1 引言
    2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料
            2.1.1 試劑及抗體
            2.1.2 細(xì)胞系
        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3 F-actin檢測(cè)
            2.3.1 Western blot檢測(cè)法
            2.3.2 熒光標(biāo)記法
            2.3.3 熒光顯微鏡下檢測(cè)法
        2.4 活性形式的RhoA,Rac1和Cdc42 蛋白的檢測(cè)
        2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)
        2.6 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)
            2.6.1 細(xì)胞總RNA的提取、總RNA的反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR
            2.6.2 miRNA的反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR
            2.6.3 miRNA抑制劑的轉(zhuǎn)染
        2.7 免疫熒光染色
        2.8 RAW264.7 細(xì)胞Ca~(2+)變化的檢測(cè)
        2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 分泌型GRP78 能夠和胞內(nèi)Ca~(2+)結(jié)合并促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生極性
        3.2 巨噬細(xì)胞的極性引起其骨架重塑
        3.3 RhoGDIA介導(dǎo)了GRP78 在促進(jìn)細(xì)胞骨架重塑中的作用
        3.4 miR-200b-3p能夠直接靶向RhoGDIA
        3.5 miR-200b-3p/RhoGDIA信號(hào)在GRP78 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用
    4 討論
    5 小結(jié)
第五章 黃連素抑制GRP78 分泌的分子機(jī)制
    1 引言
    2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料
            2.1.1 試劑及抗體
            2.1.2 質(zhì)粒和細(xì)胞系
        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        2.4 His-GRP78 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化
        2.5 外泌體的提取實(shí)驗(yàn)
        2.6 黃連素與GRP78 相互作用的確定
            2.6.1 利用游離 berberine 的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證berberine與GRP78的相互作用
            2.6.2 利用熒光光譜技術(shù)檢測(cè)berberine與 GRP78 的相互作用
            2.6.3 鑒定與berberine發(fā)生相互作用的GRP78 結(jié)構(gòu)域
        2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)
        2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 黃連素抑制了HCT-116和DLD1 細(xì)胞中GRP78 的分泌
        3.2 黃連素和GRP78 存在相互作用
        3.3 黃連素能夠與GRP78的ATP酶結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合
        3.4 黃連素通過(guò)抑制ATP酶活性調(diào)節(jié)GRP78 的構(gòu)象
    4 討論
    5 小結(jié)
第六章 高濃度黃連素通過(guò)提高胞內(nèi)GRP78 水平誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性的死亡
    1 引言
    2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料
            2.1.1 試劑及抗體
            2.1.2 細(xì)胞系和質(zhì)粒
        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3 siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        2.4 MTT實(shí)驗(yàn)
        2.5 透射電子顯微鏡(TEM)下觀察自噬小體的變化
        2.6 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、Western blot以及Co-IP實(shí)驗(yàn)
        2.7 免疫熒光染色
        2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 黃連素能夠誘導(dǎo)HCT-116、DLD1和HepG2 細(xì)胞發(fā)生自噬性的死亡
        3.2 黃連素誘導(dǎo)了HCT-116 細(xì)胞發(fā)生自噬
        3.3 自噬抑制劑阻斷了黃連素誘導(dǎo)HCT-116 細(xì)胞自噬的發(fā)生
        3.4 黃連素誘導(dǎo)DLD1和HepG2 細(xì)胞發(fā)生了自噬
        3.5 黃連素能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)GRP78 的高表達(dá)
        3.6 GRP78 在黃連素誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬過(guò)程中發(fā)揮著重要作用
        3.7 黃連素通過(guò)提高ATF6 的水平促進(jìn)了GRP78 的表達(dá)
        3.8 黃連素提高了GRP78 蛋白的穩(wěn)定性
        3.9 黃連素促進(jìn)了GRP78與VPS34 的結(jié)合
    4 討論
    5 小結(jié)
總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
縮略詞表
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)況及聯(lián)系方式


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基于1H NMR代謝組學(xué)技術(shù)探究GRP78蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞極化的干預(yù)效應(yīng)[J]. 張立超,李愛(ài)平,剌曉琴,李卓玉.  山西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2017(01)
[2]Hematopoietic stem cell-derived adipocytes and fibroblasts in the tumor microenvironment[J]. Ying Xiong,Lindsay T Mc Donald,Dayvia L Russell,Ryan R Kelly,Katie R Wilson,Meenal Mehrotra,Adam C Soloff,Amanda C LaRue.  World Journal of Stem Cells. 2015(02)



本文編號(hào)：3634775