本文關(guān)鍵詞：聚酰胺—胺與聚乙烯亞胺共聚物及其葉酸修飾的基因傳遞系統(tǒng)的構(gòu)建及性能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人類目前很多疾病用傳統(tǒng)的治療方法,手段和技術(shù)很難治愈或者難達(dá)到較好的治療效果。隨著人類基因工程計劃的完成,分子生物學(xué)及其技術(shù)的發(fā)展,人們可以從基因水平去認(rèn)識疾病,發(fā)現(xiàn)致病基因,實現(xiàn)基因治療的可能�；蛑委熅褪菍⑼庠葱灾委熁蛲ㄟ^載體傳送到病變的組織或細(xì)胞,沉默非正常的基因表達(dá),替換或者修復(fù)有缺陷的基因,從而達(dá)到治療疾病的目的。由于單純的裸基因在傳遞的過程中容易被體內(nèi)的一些生物酶降解而失去治療作用,因此基因需要載體的傳送。研究表明,載體的類型往往決定基因的傳遞效率,從而決定著治療的效果。因此,發(fā)展有效的基因載體是發(fā)展基因治療的必由之路。目前基因載體分為兩類：病毒載體與非病毒載體。病毒載體具有高效的傳遞效率,至2012年,全世界大概有至少1843例臨床試驗,取得了一定的成功。但是,病毒基因載體具有潛在的安全性問題,如免疫原性反應(yīng),引起基因突變,這些副反應(yīng)經(jīng)常會導(dǎo)致病人死亡,因此具有很大的風(fēng)險。此外,病毒載體還有制造成本高,制備復(fù)雜,基因協(xié)載量低等問題。基于這些問題,很多研究將目標(biāo)轉(zhuǎn)向了非病毒基因載體的研究。非病毒載體可以克服病毒載體的安全性問題,但是其傳遞效率低于病毒載體,往往很難達(dá)到滿意的治療效果。因此,發(fā)展高效的,高安全性的非病毒載體用于基因治療非常必要。其中,陽離子聚合物聚酰胺-胺(polyamidoamine, PAMAM)和聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)是兩類研究比較多的非病毒基因載體。一般地,高代數(shù)的PAMAM和大分子量的PEI都具有高的轉(zhuǎn)染效率,但是伴隨著很大的細(xì)胞毒性；相反,低代數(shù)的PAMAM和小分子量的PEI具有很低的細(xì)胞毒性,但伴隨著很低的轉(zhuǎn)染效率,而且這兩類載體的抗血清能力非常的差,用于臨床試驗具有很大的挑戰(zhàn)。很多研究表明,將小分子的PEI或者低代數(shù)的PAMAM通過化學(xué)修飾,如通過與生物兼容的材料集成大分子或者與疏水性的材料自組裝成納米粒都可以提高它們的轉(zhuǎn)染效率,而且同時保持相對較低的細(xì)胞毒性。盡管如此,非病毒基因載體的傳遞機(jī)制還未完全闡述清楚,這在一定程度上限制了基因載體的發(fā)展速度,導(dǎo)致在載體設(shè)計時具有盲目性。因此,本研究的重點之一是：合成一種基于低代PAMAM和小分子PEI的共聚物基因載體,期望該載體具有轉(zhuǎn)染效率高和毒性低的特點,并對他們的基因傳遞機(jī)制進(jìn)行初步揭示,了解它的基因傳遞過程。另一方面,載體要用于體內(nèi)基因治療必須具有一定的穩(wěn)定性和靶向能力。聚乙二醇化(PEGylation)常常被用來提高載體的穩(wěn)定性,降低載體與體內(nèi)陰離子型物質(zhì)的非特異性結(jié)合,延長體內(nèi)循環(huán)時間。另外,PEG還常用作配體和載體的連接劑,既可以保持PEG的優(yōu)點,同時還可以增加配體-受體結(jié)合的能力。雖然這樣的策略在一定程度上提高了系統(tǒng)的膠束穩(wěn)定性和細(xì)胞特異性,但是PEG的修飾同樣存在一些問題,主要是：降低載體的細(xì)胞攝取和溶酶體中逃逸的能力。因此,本研究的重要之二是：構(gòu)建PEG-配體修飾的PAMAM-PEI靶向基因傳遞系統(tǒng),然后嘗試通過優(yōu)化PEG末端配體密度去克服PEG作用降低的細(xì)胞攝取和進(jìn)一步提高載體的轉(zhuǎn)染活力和細(xì)胞特異性。根據(jù)上面的敘述,我們將論文分成2個部分,第一部分是合成PAMAM-PEI共聚物,對其轉(zhuǎn)染活力和細(xì)胞毒性進(jìn)行評估,初步考察它們的基因傳遞機(jī)制。第二部分工作是根據(jù)第一部分的結(jié)果去構(gòu)建一種轉(zhuǎn)染活力更高、毒性更低的PAMAM-PEI的共聚物,然后以此共聚物為基礎(chǔ)構(gòu)建葉酸靶向的基因傳遞系統(tǒng)。在研究的第一部分,我們將生物兼容性好的PAMAM G1.5和G2.5與毒性低的分支狀PEI 1800 Da通過酰胺化反應(yīng)合成一種以PAMAM為核,PEI為外層的PAMAM-PEI (PAPE)共聚物。通過紅外,核磁,GPC對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。然后考察了PAPE對DNA的壓縮能力,復(fù)合物的抗核酸酶降解能力,并對PAPE/DNA復(fù)合物的粒經(jīng),電位,形態(tài)進(jìn)行了測定。對復(fù)合物在不同細(xì)胞系上的轉(zhuǎn)染效率,毒性進(jìn)行了評估。最后對其在HEK 293T細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染機(jī)制進(jìn)行了初步研究。具體的內(nèi)容如下：(1)以PAMAM G1.5或G2.5為核心,與過量的分支狀PEI 1800通過酰胺化反應(yīng)合成PAMAM為核,PEI為外層的PAMAM-PEI共聚物。以PAMAMG1.5和G2.5為核的共聚物分別被命名為PAPE-1和PAPE-2.用紅外(FT-IR),核磁(1H NMR)和凝膠滲透色譜(GPC)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。結(jié)果顯示,在PAPEs的紅外和核磁圖譜上沒有PAMAM G1.5和G2.5上的甲酯(-COCH3)特征峰,這是由于PAMAM和PEI發(fā)生了酰胺化反應(yīng)生成了酰胺鍵導(dǎo)致其消失,且甲酯基全部參與了反應(yīng)。另外,PAPEs的紅外和核磁圖譜上出現(xiàn)了PEI和PAMAM的骨架吸收峰,這兩點共同證明了PAPE被成功合成。GPC結(jié)果表明,PAPE-1和PAPE-2為單峰圖譜且具有較小的PDI(～1.2),另外它們的水溶液是澄清透明的,這些說明PAPE成功合成而且在反應(yīng)過程中沒發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)或者程度很低。(2) PAPEs/pDNA復(fù)合物生物理化性質(zhì)的研究。利用凝膠電泳對PAPEs的基因壓縮能力進(jìn)行了評估,發(fā)現(xiàn),PAPE-1和PAPE-2在N/P=2時可以完全阻滯DNA的遷移,能力和PEI 25K相當(dāng),但稍弱于PAMAM G5.利用核酸酶降解實驗來考察PAPE對DNA的保護(hù)能力,發(fā)現(xiàn)PAPEs在N/P=2時開始呈現(xiàn)出保護(hù)能力且隨著N/P的升高而增強(qiáng)。利用馬爾文粒經(jīng)儀對PAPEs/DNA復(fù)合物的粒經(jīng)和電位進(jìn)行了測量,在所測的N/P范圍內(nèi),其平均粒徑大小處于70-200nm,電位處于+13-+33 mV.經(jīng)原子力顯微鏡(AFM)觀察,復(fù)合物在N/P=25時,呈圓球形或近圓球形形態(tài)。(3)對PAPEs/DNA復(fù)合物在不同細(xì)胞系上的轉(zhuǎn)染活力分別在有無血清的條件下進(jìn)行了評估。HEK 293T的轉(zhuǎn)染結(jié)果表明,PAPEs的轉(zhuǎn)染活力是隨著N/P的升高先提高再降低的,在無血清的條件下最優(yōu)比是N/P=25,有血清條件下的最優(yōu)轉(zhuǎn)染比是N/P=90.在N/P=25時,PAPEs的轉(zhuǎn)染活力顯著高于PEI 25K, PAMAM G5, PEI 1800的最優(yōu)轉(zhuǎn)染效率,但是弱于商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 (P0.05)。但是在有血清的轉(zhuǎn)染條件下及N/P=90時,PAPE-1和PAPE-2的轉(zhuǎn)染活力均高于所有的陽性對照(P0.05)。對BEL-7402和COS-7進(jìn)行轉(zhuǎn)染時發(fā)現(xiàn),不管有無血清,PAPEs的轉(zhuǎn)染活力均高于PEI 25K(P0.05)。另外,PAPE-2在有血清的條件下的轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到無血清條件下的水平甚至是更高。這些說明,PAPE-2是一個高效的基因載體且具有一定的抗血清能力。與PAPE-1相比,PAPE-2在血清條件下對HEK 293T, BEL-7402的轉(zhuǎn)染活力更高(P0.05)。然后,通過MTT方法首先測量了PAPEs對HeLa細(xì)胞的毒性,然后考察了PAPEs/DNA復(fù)合物在最優(yōu)轉(zhuǎn)染比時對HEK 293T, BEL-7402和COS-7的細(xì)胞毒性,PEI 25K作為對照。結(jié)果表明,PAPEs對HeLa細(xì)胞的毒性在所測濃度范圍內(nèi)均低于PEI25K(P0.05),PAPE-2的毒性在某些高濃度時大于PAPE-1(P0.05)。 PAPEs基因復(fù)合物在最優(yōu)轉(zhuǎn)染比時,各種細(xì)胞均可以保持78%以上的活力且顯著高于PEI 25K/DNA復(fù)合物(P0.05)。因此,PAPE是一類相對比PEI 25K安全的基因載體。(4)利用細(xì)胞途徑抑制劑來研究PAPEs/DNA進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制,利用共聚焦顯微鏡(CLSM)來觀察復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后其在胞內(nèi)的分布位置,利用溶酶體突破試劑-氯喹來驗證復(fù)合物是否通過溶酶體,利用aphidicolin對細(xì)胞的分裂進(jìn)行抑制研究細(xì)胞分裂對轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果表明,PAPEs/DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞主要是caveolae-mediated pathway (CvME)途徑。CLSM觀察到大部分復(fù)合物沒有與溶酶體重疊共定位在一起而且接近細(xì)胞核的邊緣,這說明大部分復(fù)合物不經(jīng)過溶酶體；為了進(jìn)一步證實這個現(xiàn)象,細(xì)胞轉(zhuǎn)染前用氯喹預(yù)處理以促進(jìn)載體逃離溶酶體從而提高轉(zhuǎn)染效率,但是復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率不能提高,這說明復(fù)合物具有足夠的緩沖能力突破溶酶體或者復(fù)合物不經(jīng)過溶酶體。綜合CLSM的結(jié)果和氯喹的作用現(xiàn)象,我們推斷PAPEs介導(dǎo)的基因傳遞都不經(jīng)過溶酶體。當(dāng)細(xì)胞核的分裂被抑制之后PAPE-1和PAPE-2基因復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率均顯著降低(t=71.811 P=.000；t=42.974 P=.000),這說明復(fù)合物入核的方式是由核分裂時“趁機(jī)”進(jìn)入的。在本文的第二部分,鑒于第一部分的結(jié)果-PAPE高效的基因傳遞效率,這很可能歸功于它的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢,雖然研究也發(fā)現(xiàn)它們的細(xì)胞毒性雖然較PEI 25K低,但是它的安全濃度范圍相對較窄,濃度在30 μg/mL就可以使HeLa細(xì)胞喪失～30%的細(xì)胞活力,因此我們首先研究了其結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)染效率、毒性間的關(guān)系,期望發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率更高和毒性更低的PAMAM-PEI共聚物。由于陽離子聚合物的毒性是和分子量是成正比的,所以我們采用支化的小分子PEI 423去替代PEI1800與PAMAM G2.5反應(yīng)合成一種具有薄PEI外層的新型的PAMAM-PEI雜交體(PME),然后對其毒性和轉(zhuǎn)染活力進(jìn)行了評估。結(jié)果表明,PME在所測細(xì)胞系上均表現(xiàn)出比PAPE-2更高的轉(zhuǎn)染效率(P0.05)同時也具有抗血清的能力,但同時它的細(xì)胞毒性顯著低于PAPE-2 (P0.05)。然后,為了進(jìn)一步提高PME的細(xì)胞特異性,我們用PEG, FA1-PEG和FA2-PEG對其進(jìn)行化學(xué)修飾,合成了具有相同PEG取代度但不同葉酸密度的PME作為靶向基因載體,同時考察葉酸密度對提高PME的轉(zhuǎn)染活力和細(xì)胞特異性的影響。利用1H NMR和UV對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。它們對基因的壓縮能力,復(fù)合物的粒徑電位進(jìn)行了測量,考察了它們的細(xì)胞毒性和溶血性,利用流式細(xì)胞儀對其轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞攝取進(jìn)行了測定,對其細(xì)胞攝取的機(jī)制用抑制劑進(jìn)行了評估,最后比較了它們在HEK293T多細(xì)胞球體上的攝取。具體的研究內(nèi)容如下：(1) PAMAM G2.5與過量的PEI 423通過酰胺化反應(yīng)合成PAMAM G2.5-PEI 423 (PME).用FT-IR,1H NMR和GPC對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,結(jié)果表明,PME被成功合成。然后對其在多種細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染活力進(jìn)行了測定,與PAPE-2相比,PME的轉(zhuǎn)染活力更高(P0.05)。它們對細(xì)胞的毒性大小進(jìn)行析因分析后發(fā)現(xiàn)載體的類型對細(xì)胞活力有顯著影響(F=485.861,P=.000),在每個濃度進(jìn)一步單獨比較,發(fā)現(xiàn)PME的細(xì)胞活力顯著高于PAPE-2 (P0.05)。另外,也發(fā)現(xiàn)PME的轉(zhuǎn)染廣譜性較強(qiáng),適合作為基因載體。據(jù)此,我們選擇PME作為母體去合成不同葉酸密度修飾的基因傳遞載體。具體的步驟是：先合成FA1-PEG或FA2-PEG,1H NMR證實了它們的結(jié)構(gòu)。然后,利用PEG, FA1-PEG或FA2-PEG修飾去PME,1H NMR和UV表征證明它們被成功合成。根據(jù)1H NMR計算,大概每分子PME接上1.69 PEG,1.66 FA1-PEG或1.72 FA2-PEG分子。這些共聚物被分別命名為：PME-(PEG3.5k)1.69, PME-(PEG3.4k-FA1)1.66和PME-(PEG3.4k-FA2)1.72.(2)利用瓊脂糖凝膠電泳對共聚物的基因壓縮能力進(jìn)行了評估,結(jié)果表明PEGylation沒有顯著影響PME的基因壓縮能力,所有的共聚物在N/P=2時可以完全阻滯DNA的遷移。利用馬爾文粒徑儀對復(fù)合物的粒徑和電位進(jìn)行了測量。復(fù)合物在N/P=10的粒徑小于200nm和具有大小合適的電位～+12-+22 mV.此外復(fù)合物具有較小的PDI(小于0.2),表明粒徑比較均一然后對共聚物及其DNA復(fù)合物的毒性進(jìn)行了評估,結(jié)果表明PEG化能夠降低PME的細(xì)胞毒性,且復(fù)合物在N/P=10-100時,細(xì)胞可以保持80%以上的細(xì)胞活力,在高濃度時載體的毒性顯著低于PEI 25K (P0.05). PEG化也可以降低載體對紅細(xì)胞的破壞,經(jīng)單因素方差分析載體間的溶血程度存在著顯著差異(F=872.320 P=.000),進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn)其溶血大小的順序是：PEI 25K PME PME-(PEG3.5k)1.69 PME-(PEG3.4k-FA1)1.66或PME-(PEG3.4k-FA2)1.72 (P0.05).(3)共聚物轉(zhuǎn)染活力的評估。對葉酸受體陽性細(xì)胞HEK 293T和HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染規(guī)律是：PME經(jīng)PEG化后轉(zhuǎn)染效率顯著降低(P0.05),當(dāng)PEG的末端連上1價FA分子后,轉(zhuǎn)染效率顯著提高(P0.05),當(dāng)PEG的末端連接上2價的FA分子之后,轉(zhuǎn)染效率再次提高(P0.05)。葉酸載體對葉酸受體低表達(dá)的A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染時,它們的轉(zhuǎn)染效率無顯著差別。因此表明,PEG末端2價葉酸的修飾優(yōu)于1價的葉酸修飾,可以更有效地提高載體的轉(zhuǎn)染活力,這個主要是由二價葉酸提高了載體的攝取導(dǎo)致的。因為細(xì)胞攝取試驗發(fā)現(xiàn),在t=0.5,1和2小時,PME-(PEG3.4k-FA2)1.72復(fù)合物的攝取效率和熒光強(qiáng)度均大于PME-(PEG3.4k-FAl)1.66復(fù)合物(P0.05)。復(fù)合物在HEK 293T多細(xì)胞球體上的攝取效率比較顯示了同樣的規(guī)律。CLSM顯示PME-(PEG3.4k-FA2)1.72復(fù)合物在球體的每個掃描層的熒光強(qiáng)度幾乎都強(qiáng)于PME-(PEG3.4k-FAl)1.66復(fù)合物。熒光強(qiáng)度定量檢測也證明了這個規(guī)律,因此,2價葉酸的修飾可以提高載體在多細(xì)胞球體上的攝取。而這些高的細(xì)胞攝取可能要歸功于2價葉酸可以提高葉酸的局部濃度和/或提供更多的受體結(jié)合位點。(4)細(xì)胞攝取機(jī)制的研究。利用游離葉酸和細(xì)胞攝取通道抑制劑研究PME-(PEG3.4k-FA2)1.722, PME-(PEG3.4k-FA1)1.66, PME-(PEG3.5k)1.69復(fù)合物的細(xì)胞攝取機(jī)制。葉酸受體陽性細(xì)胞經(jīng)游離葉酸預(yù)處理后,細(xì)胞表面的葉酸受體將被飽和。葉酸抑制試驗結(jié)果表明,PME-(PEG3.5k)1.69在HEK 293T,HeLa,A549細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染效率不受游離葉酸的影響(t=-0.932 P=0.404; t=2.563 p=0.062; t=1.921 P=0.127),但是PME-(PEG3.4k-FA2)1.72和PME-(PEG3.4k-FA1)1.66的轉(zhuǎn)染效率在葉酸受體陽性細(xì)胞上都顯著降低(t=40.434 P=.000; t=10.023 P=.001) (t=10.328 P=.000; t=14.925 p=.000而在葉酸受體陰性的A549細(xì)胞上轉(zhuǎn)染效率變化不顯著(t=1.633 P=1.178；t=1.361P=0.245),這些說明PME-(PEG3.4k-FA2)1.72和PME-(PEG3.4k-FA1)166都具有葉酸受體介導(dǎo)的攝取。相比PME-(PEG3.4k-FA1)1.66, PME-(PEG3.4k-FA2)1.72的降幅更大點,說明它更加依賴受體的介導(dǎo),即特異性更強(qiáng)。內(nèi)吞途徑抑制試驗表明PME-(PEG3.5k)1.69/DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的途徑是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(CME),但隨著PEG末端葉酸密度的升高,小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞(CvME)也逐漸變?yōu)橹饕緩健Ｍㄟ^本研究主要得出：1)PAPE具有很高的轉(zhuǎn)染活力和相對低的細(xì)胞毒性,復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞主要通過小窩蛋白調(diào)控的內(nèi)吞作用,此途徑可以減少復(fù)合物進(jìn)入溶酶體的量避免被降解,細(xì)胞分裂時的核運輸,基因表達(dá)的規(guī)律近似符合玻爾茲曼模型函數(shù)；2)利用小分子PEI 423替代PEI 1800與PAMAM G2.5反應(yīng)可以獲得轉(zhuǎn)染效率更高,毒性更低的PAMAM-PEI共聚物(PME);3)PEG末端的二價葉酸修飾比一價葉酸修飾可以更有效地提高PME的細(xì)胞特異性和克服PEG引起的細(xì)胞攝取降低,進(jìn)而提高它的轉(zhuǎn)染活力。同時也發(fā)現(xiàn)PME-(PEG3.4k-FA2)1.72對葉酸受體陽性細(xì)胞具有比PEI 25K更強(qiáng)的轉(zhuǎn)染活力,具有潛在臨床應(yīng)用價值。
【關(guān)鍵詞】：非病毒基因載體 聚酰胺-胺 聚乙烯亞胺 聚乙二醇 葉酸受體靶向 基因轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R450
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-23
• 第一章 前言23-45
• 1.1 基因治療23
• 1.2 基因載體23-25
• 1.2.1 病毒型基因載體23-24
• 1.2.2 非病毒型基因載體24-25
• 1.3 基于聚酰胺-胺(PAMAM)的基因傳遞載體25-30
• 1.3.1 PAMAM的合成方法25-27
• 1.3.2 PAMAM的化學(xué)修飾27-30
• 1.3.2.1 結(jié)構(gòu)熱活化27-28
• 1.3.2.2 氨基酸修飾28
• 1.3.2.3 PAMAM用于修飾生物兼容性材料28-29
• 1.3.2.4 強(qiáng)緩沖能力試劑的修飾29
• 1.3.2.5 低代PAMAM的交聯(lián)反應(yīng)29
• 1.3.2.6 內(nèi)核修飾29-30
• 1.4 基于聚乙烯亞胺(PEI)的基因傳遞載體30-35
• 1.4.1 PEI的化學(xué)修飾31-35
• 1.4.1.1 大分子量PEI的化學(xué)修飾31-32
• 1.4.1.2 小分子量PEI的化學(xué)修飾32-35
• 1.5 基因載體PEG修飾后的常見問題及策略35-37
• 1.6 陽離子聚合物介導(dǎo)基因的傳遞機(jī)制37-42
• 1.6.1 細(xì)胞攝取機(jī)制38-39
• 1.6.2 內(nèi)涵體/溶酶體逃逸機(jī)制39-41
• 1.6.3 入核的機(jī)制41-42
• 1.7 本研究目的、意義和內(nèi)容42-45
• 第二章 PAMAM-PEI(PAPE)聚合物的合成與表征45-57
• 2.1 試劑和儀器45-46
• 2.2 PAMAM的合成46-47
• 2.2.1 PAMAM G-0.5的合成46-47
• 2.2.2 PAMAM G0的合成47
• 2.2.3 PAMAM G1.5和G2.5的合成47
• 2.3 PAMAM-PEI(PAPE)的合成47-48
• 2.3.1 PAPE的紅外光譜分析48
• 2.3.2 PAPE的~1H NMR分析48
• 2.3.3 PAPE的GPC分析48
• 2.4 結(jié)果與討論48-56
• 2.4.1 PAMAM的合成49-50
• 2.4.2 PAPE的合成50
• 2.4.3 PAPE的紅外表征50-52
• 2.4.4 PAPE的~1H NMR分析52-54
• 2.4.5 PAPE的GPC分析54-55
• 2.4.6 PAPE的結(jié)構(gòu)分析55-56
• 2.5 本章小結(jié)56-57
• 第三章 PAPE/pDNA復(fù)合物的制備及物理性能57-69
• 3.1 試劑和儀器57-58
• 3.2 LB培養(yǎng)基的配制58
• 3.3 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化58-59
• 3.4 pEGFP-C1的大提59-60
• 3.5 PAPE/pDNA復(fù)合物的制備60
• 3.6 PAPE對pDNA的壓縮能力和保護(hù)能力分析60-61
• 3.7 PAPE/pDNA復(fù)合物的粒徑,電位和形態(tài)的測定61
• 3.8 統(tǒng)計學(xué)分析61
• 3.9 結(jié)果與討論61-68
• 3.9.1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和提取61-62
• 3.9.2 凝膠電泳分析PAPEs的基因壓縮能力62-63
• 3.9.3 PAPE/pDNA的抗核酸酶降解分析63-64
• 3.9.4 PAPE/pDNA的粒徑、電位和形態(tài)測定64-68
• 3.10 本章小結(jié)68-69
• 第四章 PAPE的基因轉(zhuǎn)染活力及毒性評估69-83
• 4.1 試劑,細(xì)胞和儀器69-70
• 4.2 試驗方法70-71
• 4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)70
• 4.2.2 體外轉(zhuǎn)染70
• 4.2.3 細(xì)胞毒性評估70-71
• 4.3 統(tǒng)計學(xué)分析71
• 4.4 結(jié)果與討論71-82
• 4.4.1 聚合物PAPE的體外轉(zhuǎn)染71-78
• 4.4.2 PAPE及其基因復(fù)合物的毒性評估78-82
• 4.5 本章小結(jié)82-83
• 第五章 PAPE/pDNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染機(jī)理初探83-98
• 5.1 試劑和儀器83-84
• 5.2 試驗方法84-86
• 5.2.1 熒光素標(biāo)記的DNA制備84-85
• 5.2.2 PAPE/pDNA復(fù)合物的攝取途徑85
• 5.2.3 PAPE/pDNA復(fù)合物經(jīng)CvME攝取的基因表達(dá)動力學(xué)85
• 5.2.4 PAPE/pDNA復(fù)合物的胞內(nèi)運輸85
• 5.2.5 氯喹和aphidicolin對轉(zhuǎn)染的影響85-86
• 5.3 統(tǒng)計學(xué)處理86
• 5.4 結(jié)果與討論86-97
• 5.4.1 質(zhì)粒DNA的熒光素標(biāo)記86
• 5.4.2 PAPE/pDNA復(fù)合物的攝取途徑86-90
• 5.4.3 PAPE/pDNA的基因表達(dá)動力學(xué)90-92
• 5.4.4 PAPE/pDNA復(fù)合物的胞內(nèi)過程92-94
• 5.4.5 氯喹與aphidicolin對PAPE/pDNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率的影響94-97
• 5.5 本章小結(jié)97-98
• 第六章 PME的合成、表征及生物學(xué)性能評價98-111
• 6.1 試劑、儀器及細(xì)胞98-99
• 6.2 試驗方法99-100
• 6.2.1 PAMAM G2.5-PEI 423共聚物(PME)的合成99
• 6.2.2 PME的結(jié)構(gòu)分析99
• 6.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)99-100
• 6.2.4 轉(zhuǎn)染100
• 6.2.5 細(xì)胞毒性評估100
• 6.3 統(tǒng)計學(xué)分析100-101
• 6.4 結(jié)果與討論101-110
• 6.4.1 PME的合成與表征101-103
• 6.4.2 聚合物PME轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞103-105
• 6.4.3 聚合物PME/pDNA在最優(yōu)比轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞系105-108
• 6.4.4 聚合物PME的細(xì)胞毒性108-110
• 6.5 本章小結(jié)110-111
• 第七章 PME-PEG-FA共聚物的合成、表征及其生物相容性評估111-128
• 7.1 試劑和儀器112
• 7.2 試驗方法112-115
• 7.2.1 COOH-PEG_(3.4k)-FA_1和COOH-PEG_(3.4k)-FA_2的合成113
• 7.2.2 PME-PEG_(3.4k)-FA_1,PME-PEG_(3.5k),PME-PEG_(3.4k)-FA_2的合成113-114
• 7.2.3 聚合物的表征114
• 7.2.4 細(xì)胞毒性114
• 7.2.5 溶血分析114-115
• 7.3 統(tǒng)計學(xué)分析115
• 7.4 結(jié)果與討論115-127
• 7.4.1 COOH-PEG_(3.4k)-FA_1和COOH-PEG_(3.4k)-FA_2的合成及表征115-117
• 7.4.2 PME-PEG_(3.4k)-FA_2,PME-PEG_(3.4k)-FA_1,PME-PEG的合成及表征117-121
• 7.4.3 聚合物及其基因復(fù)合物的細(xì)胞毒性和復(fù)合物的溶血分析121-127
• 7.5 本章小結(jié)127-128
• 第八章 聚合物/pDNA復(fù)合物的物理性能及體外轉(zhuǎn)染研究128-138
• 8.1 試劑和儀器128-129
• 8.2 試驗方法129
• 8.2.1 瓊脂糖凝膠阻滯實驗129
• 8.2.2 PME-(PEG_(3.4)k-FA_2)_(1.72)/pDNA復(fù)合物的粒徑和電位測量129
• 8.2.3 體外轉(zhuǎn)染129
• 8.3 統(tǒng)計學(xué)分析129-130
• 8.4 結(jié)果與討論130-136
• 8.4.1 壓縮能力分析130-131
• 8.4.2 粒徑、電位測定131-132
• 8.4.3 聚合物的體外轉(zhuǎn)染132-136
• 8.5 本章小結(jié)136-138
• 第九章 PME-(PEG_(3.4k)-FA_2)_(1.72)/pDNA復(fù)合物的細(xì)胞攝取138-148
• 9.1 試劑和儀器138-139
• 9.2 2D細(xì)胞攝取139
• 9.3 3D多細(xì)胞球體的攝取139-140
• 9.4 統(tǒng)計學(xué)分析140
• 9.5 結(jié)果與討論140-147
• 9.5.1 2D細(xì)胞攝取分析140-145
• 9.5.2 3D細(xì)胞攝取分析145-147
• 9.6 本章小結(jié)147-148
• 第十章 PME-(PEG_(3.4k)-FA_2)_(1.72)/pDNA復(fù)合物的細(xì)胞攝取機(jī)制148-156
• 10.1 試劑和儀器148
• 10.2 葉酸競爭性試驗和攝取途徑148-149
• 10.3 統(tǒng)計學(xué)分析149
• 10.4 結(jié)果與討論149-155
• 10.4.1 載體的細(xì)胞特異性和攝取途徑分析149-155
• 10.5 本章小結(jié)155-156
• 參考文獻(xiàn)156-173
• 全文總結(jié)與創(chuàng)新點173-175
• 中英文縮寫詞表175-178
• 致謝178-180
• 攻讀博士期間論文成果180-182
• 統(tǒng)計學(xué)審稿證明182

  本文關(guān)鍵詞：聚酰胺—胺與聚乙烯亞胺共聚物及其葉酸修飾的基因傳遞系統(tǒng)的構(gòu)建及性能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：335516