背景和目的:對于肝臟腫瘤、終末期肝病等肝臟疾病而言,肝部分切除術和肝移植術已成為一種常規(guī)且有效的治療方法。隨著人們生活水平的提升和生活方式的改變,肥胖已經(jīng)成為一個全球普遍的現(xiàn)象,隨之而來的是非酒精性脂肪性肝�。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）發(fā)病率的快速增加。NAFLD的高發(fā)病率,導致符合要求的正常供肝越來越少。等待肝臟移植的患者與器官供應短缺之間的矛盾日漸嚴峻,促使脂肪肝作為一個邊緣供肝在臨床上越來越多的被應用。在臨床工作中,脂肪肝接受肝臟手術,如肝部分切術,也越來越普遍。與正常肝臟相比,脂肪肝更容易遭受脂質過氧化損傷,對缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury,IRI）的敏感性升高、耐受性降低,是影響肝部分切除術和肝移植術后死亡率的一個重要因素。肝再生增強因子（augmenter of liver regeneration,ALR）,最初是從初斷乳大鼠的肝臟或肝部分切除大鼠的肝臟中提取出一種蛋白,可以促進肝臟再生。后來研究發(fā)現(xiàn)ALR對多種不同類型的肝臟損傷亦具有保護作用。最近研究表明ALR與肝臟IRI亦... 

【文章來源】：首都醫(yī)科大學北京市

【文章頁數(shù)】：156 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
前言
材料與方法
    1、實驗材料
        1.1 材料及來源
        1.2 主要儀器
        1.3 常用液體的配制
    2、實驗方法
        第一部分：建立小鼠脂肪肝模型，并進行肝臟缺血/再灌注損傷（IRI），觀察過表達ALR對肝臟IRI有無保護作用
            2.1 確定ALR重組腺病毒載體注射劑量及注射時間
            2.2 觀察腺病毒對肝細胞有無損傷作用
            2.3 建立脂肪肝小鼠肝臟IRI模型
            2.4 標本收集
            2.5 肝組織TG含量檢測
            2.6 油紅O染色觀察肝細胞內TG堆積情況
            2.7 觀察外源性ALR基因在肝組織中的表達情況
            2.8 血清學指標檢測
            2.9 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色觀察肝組織學形態(tài)變化
            2.10 檢測脂肪肝小鼠IRI后肝細胞的凋亡水平
            2.11 肝組織脂質過氧化產物測定
            2.12 檢測脂肪肝小鼠肝臟IRI后肝臟的抗氧化能力
            2.13 肝組織中ATP水平檢測
            2.14 檢測脂肪肝IRI后肝組織內的炎癥反應
            2.15 IHC法檢測肝組織中增殖細胞核抗原 (Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA) 表達水平
        第二部分：脂肪變HepG2細胞缺氧/復氧（H/R）損傷模型建立及ALR對其保護作用研究
            2.16 建立穩(wěn)定轉染ALR-pcDNA 3.0 和Vector-pcDNA 3.0 的HepG2細胞系
            2.17 ALR-Tx和Vector-Tx細胞系培養(yǎng)
            2.18 用OA/PA混合液誘導ALR-Tx和Vector-Tx細胞脂肪變性
            2.19 檢測OA/PA混合液誘導后細胞脂變情況
            2.20 建立細胞H/R損傷模型
            2.21 脂變細胞H/R損傷后細胞活力檢測（CCK8實驗）
            2.22 觀察脂變細胞H/R損傷后細胞凋亡情況
            2.23 檢測脂變細胞H/R損傷后細胞內總ROS含量
        第三部分：探討ALR高表達對脂肪肝小鼠肝臟IRI保護的可能機制
            2.24 脂變細胞H/R損傷后線粒體相關功能檢測
            2.25 脂變細胞H/R損傷后的細胞抗氧化能力檢測
            2.26 統(tǒng)計學分析
實驗結果
    第一部分：建立脂肪肝小鼠肝臟IRI模型，觀察過表達ALR對肝臟IRI的保護作用
        1. 構建AD-FLAG-ALR腺病毒載體
        2. C57BL/6 小鼠脂肪肝模型的建立
        3. ALR重組腺病毒在脂肪肝小鼠肝臟內高效表達ALR蛋白
        4. 腺病毒注射3天對肝功能無明顯影響
        5. ALR減輕脂肪肝小鼠肝臟IRI后肝功能損害
            5.1 ALR降低血清中ALT，AST，LDH水平
            5.2 ALR保護脂肪肝小鼠抵御肝臟IRI打擊的組織學證據(jù)
        6. ALR抑制脂肪肝小鼠IRI導致的肝細胞凋亡
            6.1 ALR改變肝組織中凋亡相關蛋白Bcl-2, Bax和cleaved Caspase-3 的表達水平
            6.2 ALR減少肝組織中cleaved Caspase-3 陽性細胞數(shù)量
            6.3 ALR減少肝組織中TUNEL陽性細胞數(shù)
        7. ALR減輕肝細胞脂質過氧化反應
            7.1 ALR減少脂肪肝組織內MDA含量
            7.2 ALR降低脂肪肝組織中 4-HNE表達水平
        8. ALR提高肝細胞抗氧化能力
        9. ALR治療組動物經(jīng)受肝臟IRI打擊后肝組織ATP含量改變
        10. ALR抑制脂肪肝IRI的炎癥反應
            10.1 ALR降低炎癥因子TNF-a, IL-1b, IL-6 和趨化因子CXCL2的mRNA水平
            10.2 ALR抑制肝組織KCs活化
        11. ALR促進脂肪肝IRI后的細胞增殖
    第二部分：脂肪變HepG2細胞缺氧/復氧（H/R）損傷模型建立及ALR對其保護作用研究
        12. 外源性ALR基因在HEPG2細胞內穩(wěn)定表達
            12.1 構建含ALR基因的pcDNA3.0 質粒
            12.2 建立穩(wěn)定高表達ALR蛋白的HepG2細胞
        13. OA/PA混合液誘導HEPG2細胞脂肪變
            13.1 脂變細胞內脂滴堆積明顯
            13.2 脂變細胞內TG含量明顯增高
        14. ALR提高脂變細胞H/R損傷后的細胞活力
        15. ALR抑制脂變細胞H/R損傷后的細胞凋亡
            15.1 ALR降低脂變細胞H/R損傷后的Caspase-3 活性
            15.2 ALR促進脂變細胞H/R損傷后凋亡相關蛋白Bcl-2 的表達
            15.3 ALR降低脂變細胞H/R損傷后的TUNEL陽性細胞數(shù)
        16. ALR抑制細胞ROS的產生
    第三部分：探討ALR保護脂肪肝小鼠肝臟IRI的可能機制
        17. ALR保護H/R損傷細胞的線粒體功能
            17.1 ALR抑制H/R損傷細胞線粒體ROS產生
            17.2 ALR穩(wěn)定細胞H/R損傷后線粒體膜電位
            17.3 ALR增強脂變細胞H/R損傷后線粒體氧化磷酸化反應
            17.4 ALR提高脂變細胞H/R損傷后的ATP含量
        18. ALR增強H/R損傷細胞的抗氧化能力
            18.1 ALR增強H/R損傷細胞的SOD活性
            18.2 ALR提高細胞MnSOD蛋白表達水平
            18.3 ALR增強MnSOD轉錄水平
            18.4 ALR增強H/R損傷細胞的GSH活性
討論
結論
參考文獻
文獻綜述
    參考文獻
英文縮略詞表
攻讀學位期間發(fā)表文章情況
致謝
個人簡歷



本文編號：3335123