背景和目的:對(duì)于肝臟腫瘤、終末期肝病等肝臟疾病而言,肝部分切除術(shù)和肝移植術(shù)已成為一種常規(guī)且有效的治療方法。隨著人們生活水平的提升和生活方式的改變,肥胖已經(jīng)成為一個(gè)全球普遍的現(xiàn)象,隨之而來的是非酒精性脂肪性肝�。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）發(fā)病率的快速增加。NAFLD的高發(fā)病率,導(dǎo)致符合要求的正常供肝越來越少。等待肝臟移植的患者與器官供應(yīng)短缺之間的矛盾日漸嚴(yán)峻,促使脂肪肝作為一個(gè)邊緣供肝在臨床上越來越多的被應(yīng)用。在臨床工作中,脂肪肝接受肝臟手術(shù),如肝部分切術(shù),也越來越普遍。與正常肝臟相比,脂肪肝更容易遭受脂質(zhì)過氧化損傷,對(duì)缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury,IRI）的敏感性升高、耐受性降低,是影響肝部分切除術(shù)和肝移植術(shù)后死亡率的一個(gè)重要因素。肝再生增強(qiáng)因子（augmenter of liver regeneration,ALR）,最初是從初斷乳大鼠的肝臟或肝部分切除大鼠的肝臟中提取出一種蛋白,可以促進(jìn)肝臟再生。后來研究發(fā)現(xiàn)ALR對(duì)多種不同類型的肝臟損傷亦具有保護(hù)作用。最近研究表明ALR與肝臟IRI亦... 

【文章來源】：首都醫(yī)科大學(xué)北京市

【文章頁數(shù)】：156 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
前言
材料與方法
    1、實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 材料及來源
        1.2 主要儀器
        1.3 常用液體的配制
    2、實(shí)驗(yàn)方法
        第一部分：建立小鼠脂肪肝模型，并進(jìn)行肝臟缺血/再灌注損傷（IRI），觀察過表達(dá)ALR對(duì)肝臟IRI有無保護(hù)作用
            2.1 確定ALR重組腺病毒載體注射劑量及注射時(shí)間
            2.2 觀察腺病毒對(duì)肝細(xì)胞有無損傷作用
            2.3 建立脂肪肝小鼠肝臟IRI模型
            2.4 標(biāo)本收集
            2.5 肝組織TG含量檢測(cè)
            2.6 油紅O染色觀察肝細(xì)胞內(nèi)TG堆積情況
            2.7 觀察外源性ALR基因在肝組織中的表達(dá)情況
            2.8 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)
            2.9 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色觀察肝組織學(xué)形態(tài)變化
            2.10 檢測(cè)脂肪肝小鼠IRI后肝細(xì)胞的凋亡水平
            2.11 肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物測(cè)定
            2.12 檢測(cè)脂肪肝小鼠肝臟IRI后肝臟的抗氧化能力
            2.13 肝組織中ATP水平檢測(cè)
            2.14 檢測(cè)脂肪肝IRI后肝組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)
            2.15 IHC法檢測(cè)肝組織中增殖細(xì)胞核抗原 (Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA) 表達(dá)水平
        第二部分：脂肪變HepG2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷模型建立及ALR對(duì)其保護(hù)作用研究
            2.16 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ALR-pcDNA 3.0 和Vector-pcDNA 3.0 的HepG2細(xì)胞系
            2.17 ALR-Tx和Vector-Tx細(xì)胞系培養(yǎng)
            2.18 用OA/PA混合液誘導(dǎo)ALR-Tx和Vector-Tx細(xì)胞脂肪變性
            2.19 檢測(cè)OA/PA混合液誘導(dǎo)后細(xì)胞脂變情況
            2.20 建立細(xì)胞H/R損傷模型
            2.21 脂變細(xì)胞H/R損傷后細(xì)胞活力檢測(cè)（CCK8實(shí)驗(yàn)）
            2.22 觀察脂變細(xì)胞H/R損傷后細(xì)胞凋亡情況
            2.23 檢測(cè)脂變細(xì)胞H/R損傷后細(xì)胞內(nèi)總ROS含量
        第三部分：探討ALR高表達(dá)對(duì)脂肪肝小鼠肝臟IRI保護(hù)的可能機(jī)制
            2.24 脂變細(xì)胞H/R損傷后線粒體相關(guān)功能檢測(cè)
            2.25 脂變細(xì)胞H/R損傷后的細(xì)胞抗氧化能力檢測(cè)
            2.26 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    第一部分：建立脂肪肝小鼠肝臟IRI模型，觀察過表達(dá)ALR對(duì)肝臟IRI的保護(hù)作用
        1. 構(gòu)建AD-FLAG-ALR腺病毒載體
        2. C57BL/6 小鼠脂肪肝模型的建立
        3. ALR重組腺病毒在脂肪肝小鼠肝臟內(nèi)高效表達(dá)ALR蛋白
        4. 腺病毒注射3天對(duì)肝功能無明顯影響
        5. ALR減輕脂肪肝小鼠肝臟IRI后肝功能損害
            5.1 ALR降低血清中ALT，AST，LDH水平
            5.2 ALR保護(hù)脂肪肝小鼠抵御肝臟IRI打擊的組織學(xué)證據(jù)
        6. ALR抑制脂肪肝小鼠IRI導(dǎo)致的肝細(xì)胞凋亡
            6.1 ALR改變肝組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2, Bax和cleaved Caspase-3 的表達(dá)水平
            6.2 ALR減少肝組織中cleaved Caspase-3 陽性細(xì)胞數(shù)量
            6.3 ALR減少肝組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)
        7. ALR減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)
            7.1 ALR減少脂肪肝組織內(nèi)MDA含量
            7.2 ALR降低脂肪肝組織中 4-HNE表達(dá)水平
        8. ALR提高肝細(xì)胞抗氧化能力
        9. ALR治療組動(dòng)物經(jīng)受肝臟IRI打擊后肝組織ATP含量改變
        10. ALR抑制脂肪肝IRI的炎癥反應(yīng)
            10.1 ALR降低炎癥因子TNF-a, IL-1b, IL-6 和趨化因子CXCL2的mRNA水平
            10.2 ALR抑制肝組織KCs活化
        11. ALR促進(jìn)脂肪肝IRI后的細(xì)胞增殖
    第二部分：脂肪變HepG2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷模型建立及ALR對(duì)其保護(hù)作用研究
        12. 外源性ALR基因在HEPG2細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)
            12.1 構(gòu)建含ALR基因的pcDNA3.0 質(zhì)粒
            12.2 建立穩(wěn)定高表達(dá)ALR蛋白的HepG2細(xì)胞
        13. OA/PA混合液誘導(dǎo)HEPG2細(xì)胞脂肪變
            13.1 脂變細(xì)胞內(nèi)脂滴堆積明顯
            13.2 脂變細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯增高
        14. ALR提高脂變細(xì)胞H/R損傷后的細(xì)胞活力
        15. ALR抑制脂變細(xì)胞H/R損傷后的細(xì)胞凋亡
            15.1 ALR降低脂變細(xì)胞H/R損傷后的Caspase-3 活性
            15.2 ALR促進(jìn)脂變細(xì)胞H/R損傷后凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 的表達(dá)
            15.3 ALR降低脂變細(xì)胞H/R損傷后的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)
        16. ALR抑制細(xì)胞ROS的產(chǎn)生
    第三部分：探討ALR保護(hù)脂肪肝小鼠肝臟IRI的可能機(jī)制
        17. ALR保護(hù)H/R損傷細(xì)胞的線粒體功能
            17.1 ALR抑制H/R損傷細(xì)胞線粒體ROS產(chǎn)生
            17.2 ALR穩(wěn)定細(xì)胞H/R損傷后線粒體膜電位
            17.3 ALR增強(qiáng)脂變細(xì)胞H/R損傷后線粒體氧化磷酸化反應(yīng)
            17.4 ALR提高脂變細(xì)胞H/R損傷后的ATP含量
        18. ALR增強(qiáng)H/R損傷細(xì)胞的抗氧化能力
            18.1 ALR增強(qiáng)H/R損傷細(xì)胞的SOD活性
            18.2 ALR提高細(xì)胞MnSOD蛋白表達(dá)水平
            18.3 ALR增強(qiáng)MnSOD轉(zhuǎn)錄水平
            18.4 ALR增強(qiáng)H/R損傷細(xì)胞的GSH活性
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
英文縮略詞表
攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3335123