本文關(guān)鍵詞：VEGF-C基因促進(jìn)胃癌淋巴管形成及相關(guān)miRNAs鑒定實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的：胃癌是常見惡性腫瘤之一,盡管胃癌的發(fā)病率近幾十年來有所下降,但在世界范圍內(nèi),尤其是亞洲東部地區(qū),每年的新發(fā)病例量卻不斷在增加。目前全世界所有因惡性腫瘤死亡病例中,因胃癌導(dǎo)致的死亡已高達(dá)10%左右,在所有因腫瘤導(dǎo)致的死亡原因中僅次于肺癌排第二位。淋巴轉(zhuǎn)移是胃癌遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的主要途徑,也是促使胃癌患者死亡的重要因素。然而由于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)期以來沒有很好的特異性標(biāo)志物,對(duì)其研究相對(duì)是個(gè)盲區(qū),因此,破解淋巴道轉(zhuǎn)移之謎,成為了攻克胃癌的瓶頸問題,目前淋巴管生成(Lymphangiogenesis)已成為腫瘤轉(zhuǎn)移研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。已有的相關(guān)研究報(bào)道胃癌組織中VEGF-C的表達(dá)增加,提示可能VEGF-C在胃癌淋巴轉(zhuǎn)移中產(chǎn)生作用,盡管已有大量關(guān)于VEGF-C基因的研究,但在胃癌的淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制研究當(dāng)中,單單憑VEGF-C分泌增多及其直接促進(jìn)淋巴管生成效應(yīng)不足以解釋,這就促使我們尋找其調(diào)控機(jī)制。本研究寄希望通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù),構(gòu)建高表達(dá)VEGF-C基因人胃癌細(xì)胞株,在體外觀察人胃癌細(xì)胞中VEGF-C基因高表達(dá)對(duì)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞管形成能力的影響,并借助于人胃癌誘導(dǎo)過的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞與未處理的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對(duì)象,應(yīng)用高通量的miRNAs芯片技術(shù)比較兩者miRNAs表達(dá)譜的差異水平,尋找人胃癌淋巴管生成相關(guān)的miRNAs,深入探索人胃癌淋巴管生成的調(diào)控機(jī)制。方法：通過熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western Blot方法檢測(cè)VEGF-C在不同類型的人胃癌細(xì)胞株(BGC-823、NCI-N87、SGC-7901、MKN-45、MKN-28、GES-1) 中mRNA及蛋白的表達(dá)水平,并確定VEGF-C基因或蛋白水平表達(dá)較低的細(xì)胞株(MKN-45)作為目的細(xì)胞。通過構(gòu)建人VEGF-C基因過表達(dá)慢病毒載體并感染目的細(xì)胞,建立胃癌促淋巴管生成的體外模型,觀察VEGF-C基因高表達(dá)對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞管形成能力的影響實(shí)驗(yàn)對(duì)象分為三組,其中以VEGF-C過表達(dá)慢病毒載體感染細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組、空白病毒轉(zhuǎn)染為對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞為空白組。應(yīng)用高通量miRNAs芯片技術(shù)篩選腫瘤誘導(dǎo)過的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和未處理的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞差異表達(dá)的miRNAs,采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)部分候選人胃癌淋巴管生成相關(guān)miRNA在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中進(jìn)行初步驗(yàn)證。結(jié)果：1.通過qRT-PCR及Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明：在實(shí)驗(yàn)選取的六種不同類型的人胃癌細(xì)胞中均可檢測(cè)VEGF-C mRNA及蛋白的表達(dá),但其中MKN-45中表達(dá)相對(duì)最低,而SGC-7901中表達(dá)相對(duì)最高；2.構(gòu)建VEGF-C過表達(dá)慢病毒載體,并對(duì)MKN-45細(xì)胞成功進(jìn)行感染：熒光顯微鏡觀察其效率可達(dá)90%以上,且在基因及蛋白水平分別進(jìn)行驗(yàn)證；3.淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞管形成實(shí)驗(yàn)顯示：收集實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組細(xì)胞的培養(yǎng)上清,分別加入淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)體系中,觀察其小管的形成數(shù)目及小管長(zhǎng)度分別也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；4.高通量microRNAs芯片：腫瘤誘導(dǎo)過的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和未處理的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞miRNA表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)89個(gè)miRNAs表達(dá)水平有顯著差異,其中47個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào),42個(gè)niRNA表達(dá)下調(diào)；5.應(yīng)用qRT-PCR方法鑒定RNA芯片篩選的部分miRNAs:通過對(duì)收集的有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),]miR-648, miR-5002-3p, miR-4754, miR-4760-5p, miR-4491, miR-4252, miR-5007-3p及miR-647表達(dá)上調(diào),miR-3178, miR-593-5p, miR-4485, miR-135a-3p, miR-17, miR-1469及miR-124-5p表達(dá)下調(diào),同芯片結(jié)果較為一致。結(jié)論：1.體外胃癌促淋巴管生成模型建立成功；2.明確胃癌細(xì)胞VEGF-C基因高表達(dá)促進(jìn)淋巴管新生能力；3.胃癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs的篩選及部分鑒定。
【關(guān)鍵詞】：胃腫瘤 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C 淋巴管生成 微小RNA
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 符號(hào)說明12-13
• 第一部分 VEGF-C基因促進(jìn)胃癌淋巴管形成實(shí)驗(yàn)研究13-38
• 前言13-14
• 材料與方法14-30
• 結(jié)果30-13
• 討論13-35
• 小結(jié)35-36
• 參考文獻(xiàn)36-38
• 第二部分 胃癌淋巴管形成相關(guān)miRNA高通量篩選和鑒定研究38-54
• 前言38-39
• 材料與方法39-46
• 結(jié)果46-39
• 討論39-52
• 結(jié)論52
• 參考文獻(xiàn)52-54
• 綜述54-64
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 致謝64-65
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文65-66
• 附件66-93

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本文編號(hào)：331034