p53作為一個(gè)重要的抑癌蛋白,其蛋白水平在細(xì)胞內(nèi)需要受到嚴(yán)格的調(diào)控。作為體內(nèi)最為關(guān)鍵的p53負(fù)調(diào)因子,E3泛素連接酶Mdm2能夠結(jié)合并催化p53發(fā)生多聚泛素化修飾,進(jìn)而促使p53通過蛋白酶體途徑降解。在我們的研究中,我們鑒定了 MARCH7是Mdm2一個(gè)新的相互作用蛋白。有意思的是,和傳統(tǒng)E3泛素連接酶介導(dǎo)底物降解的作用不同,MARCH7作為一個(gè)E3泛素連接酶能夠穩(wěn)定Mdm2的蛋白水平。MARCH7也能夠通過穩(wěn)定Mdm2,進(jìn)而促進(jìn)p53多聚泛素化和蛋白降解。在分子機(jī)制上,我們發(fā)現(xiàn)MARCH7能夠在體內(nèi)外特異性地催化Mdm2形成K63-依賴的多聚泛素鏈,進(jìn)而抑制Mdm2的自身泛素化和降解。在功能上,MARCH7能夠通過調(diào)控p53的表達(dá)水平,從而控制細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、克隆形成以及裸鼠移植瘤生長(zhǎng)。我們的這一工作揭示了一種全新的Mdm2蛋白穩(wěn)定性調(diào)控模式,并表明MARCH7是Mdm2-p53通路的一個(gè)重要調(diào)控因子。p53作為抑癌蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。雖然p53抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的功能已被人們逐漸認(rèn)識(shí),然而其潛在的分子機(jī)制目前仍然不是很明確。在我們的另一項(xiàng)研究中,我們鑒定了一個(gè)... 

【文章來源】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：111 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 癌癥與健康
    1.2 p53與腫瘤
    1.3 Mdm2與腫瘤
    1.4 MARCH7研究進(jìn)展
    1.5 Arp2/3復(fù)合體研究進(jìn)展
    1.6 研究的內(nèi)容與意義
第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞及小鼠來源
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.4 抗體
        2.1.5 引物
    2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
    2.3 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.1 目的條帶擴(kuò)增
        2.3.2 瓊脂糖凝膠電泳
        2.3.3 PCR產(chǎn)物膠回收
        2.3.4 目的片段雙酶切及連接
        2.3.5 轉(zhuǎn)化及單克隆鑒定
        2.3.6 大腸桿菌感受態(tài)制備
        2.3.7 shRNA質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.8 Axygen質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒
        2.3.9 堿法質(zhì)粒粗提
    2.4 蛋白質(zhì)印記
    2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        2.5.1 總RNA提取
        2.5.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA
        2.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
    2.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與病毒感染
        2.6.1 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        2.6.2 病毒感染
    2.7 免疫共沉淀
    2.8 蛋白表達(dá)及純化
    2.9 體內(nèi)外泛素化實(shí)驗(yàn)
        2.9.1 體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)
        2.9.2 體外泛素化實(shí)驗(yàn)
    2.10 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
    2.11 免疫熒光實(shí)驗(yàn)
    2.12 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)
    2.13 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)
    2.14 GST pull-down實(shí)驗(yàn)
    2.15 染色體免疫沉淀（CHIP)實(shí)驗(yàn)
    2.16 Pyrene actin聚合實(shí)驗(yàn)
    2.17 Actin負(fù)染電鏡觀察
        2.17.1 Actin聚合反應(yīng)
        2.17.2 負(fù)染電鏡觀察actin分支情況
    2.18 細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)
    2.19 單細(xì)胞追蹤實(shí)驗(yàn)
    2.20 體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)
    2.21 數(shù)據(jù)重復(fù)性和統(tǒng)計(jì)分析
第三章 結(jié)果與討論
    第一部分 MARCH7調(diào)控Mdm2-p53信號(hào)通路
        3.1 MARCH7是Mdm2的互作蛋白
            3.1.1 MARCH7與Mdm2在體內(nèi)外相互作用
            3.1.2 MARCH7與Mdm2結(jié)合的區(qū)段分析
        3.2 MARCH7增加Mdm2的蛋白穩(wěn)定性
            3.2.1 MARCH7增加野生型Mdm2蛋白水平
            3.2.2 MARCH7調(diào)節(jié)Mdm2穩(wěn)定性
        3.3 MARCH7促進(jìn)Mdm2依賴的p53多聚泛素化和降解
            3.3.1 MARCH7調(diào)節(jié)Mdm2-p53信號(hào)軸
            3.3.2 MARCH7通過Mdm2調(diào)節(jié)p53多聚泛素化和降解
            3.3.3 MARCH7調(diào)節(jié)p53轉(zhuǎn)錄活性
        3.4 MARCH7催化Mdm2形成K63連接的多聚泛素化
            3.4.1 MARCH7增強(qiáng)Mdm2 C464A多聚泛素化
            3.4.2 MARCH7能夠促進(jìn)Mdm2 K63連接的多聚泛素鏈形成
        3.5 MARCH7以p53依賴的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生
            3.5.1 MARCH7以p53依賴的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖
            3.5.2 MARCH7調(diào)控Mdm2本底水平控制p53對(duì)DNA損傷的響應(yīng)
            3.5.3 MARCH7調(diào)控p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
            3.5.4 MARCH7調(diào)控p53介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生
        3.6 討論
    第二部分 WDR63介導(dǎo)p53抑制腫瘤轉(zhuǎn)移
        4.1 WDR63抑制細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移
            4.1.1 WDR63抑制細(xì)胞劃痕愈合和遷移
            4.1.2 WDR63抑制細(xì)胞侵襲
            4.1.3 WDR63抑制腫瘤轉(zhuǎn)移
            4.1.4 WDR63不影響細(xì)胞增殖、凋亡和周期阻滯
        4.2 WDR63是p53直接的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)
            4.2.1 p53正向調(diào)控WDR63的表達(dá)
            4.2.2 p53直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控WDR63
        4.3 WDR63與Arp2/3復(fù)合體相互作用
            4.3.1 WDR63與Arp2在體內(nèi)外相互作用
            4.3.2 WDR63是Arp2/3復(fù)合體的新型結(jié)合蛋白
        4.4 WDR63抑制Arp2/3介導(dǎo)的actin聚合
            4.4.1 WDR63抑制Arp2/3介導(dǎo)的actin聚合
            4.4.2 WDR63與VCA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Arp2/3復(fù)合體
        4.5 WDR63通過Arp2/3復(fù)合體抑制細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲
            4.5.1 WDR63通過Arp2/3抑制細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲
            4.5.2 與Arp2/3復(fù)合體結(jié)合是WDR63抑制細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲必須的
        4.6 WDR6介導(dǎo)p53抑制細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移功能
        4.7 討論
參考文獻(xiàn)
致謝
在讀期間發(fā)表的論文及取得的成果



本文編號(hào)：3169270