G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptors,GPCRs）是細胞表面最重要的受體之一,它涉及到一系列細胞的代謝和信號傳導(dǎo)過程,與許多重大疾病相關(guān),同時也是許多環(huán)境激素的靶點,也是藥物開發(fā)的重要靶點。目前利用GPCRs也開發(fā)了一些的檢測和藥物篩選技術(shù)和方法,但它們都存在敏感性不高、自動化程度低等缺點,因此如何利用不同受體的特點開發(fā)特異性強、靈敏性高和穩(wěn)定性好的檢測和篩選技術(shù)是我們亟待解決的問題。本論文為更好地避免N末端標(biāo)記可能會對受體配件結(jié)合的影響,通過基因工程技術(shù)構(gòu)建以綠色熒光蛋白（Green fluorescence protein,GFP）標(biāo)記受體C末端的重組細胞系的策略,以期最大限度地降低融合蛋白對受體與配體結(jié)合的影響;又利用高內(nèi)涵篩選（High Content Screening,HCS）技術(shù),建立起可對樣品進行可視化和自動化的檢測和篩選系統(tǒng)。首先,論文選擇將綠色熒光蛋白（tGFP）直接標(biāo)記在雌激素受體α（Estrogen Receptorα,ERα）受體的C末端的重組細胞系構(gòu)建策略。首先構(gòu)建了ERα/pCMV6穿梭質(zhì)粒,其中含CMV真核啟動,而SV4... 

【文章來源】：昆明理工大學(xué)云南省

【文章頁數(shù)】：163 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

GPCR的基本結(jié)構(gòu)

掀?⒎纖?⒐?fàn)C邐廴炯霸胍簟⒎?湮廴盡Ｒ部梢園次廴鏡男?質(zhì)分為物理污染和化學(xué)污染。到目前為止，在各式各樣環(huán)境污染的因素中，化學(xué)污染最為嚴(yán)重，約占總污染的80%到90%，是公認的潛在危害最大的一類污染因素。據(jù)統(tǒng)計，在目前已知的2000多萬種化學(xué)物質(zhì)中已經(jīng)確認對人體健康和生態(tài)環(huán)境具有潛在危害。而目前人們新開發(fā)的化學(xué)物質(zhì)仍然以每周約600種的速度在增長，這些化合物最終都將進入到環(huán)境中，并通過在不同介質(zhì)間擴散、遷移、轉(zhuǎn)化或積累，并不斷地與環(huán)境相互作用，最終對人類和其他各種生態(tài)系統(tǒng)的生存和發(fā)展帶來顯著的影響（圖1.2）。因此，如何有效地檢測、監(jiān)測、評價和消除導(dǎo)致環(huán)境污染的化學(xué)物質(zhì)是環(huán)境科學(xué)面臨的一項重大科學(xué)問題。圖1.2環(huán)境與化學(xué)物質(zhì)的相互作用[57]Fig.1.2Theinteractionoftheenvironmentwithchemicals1.3.2化學(xué)污染物及其分類目前全球已合成的各種化學(xué)物質(zhì)已超過2000多萬種，而每年新登記注冊投放市場的新化合物仍然以約3000種/年的速度在增長。僅以我國為例，已能合成的化學(xué)藥品已超過3.7萬種。這些化學(xué)藥品在撲滅蟲害、提高來的生產(chǎn)力、減少疾并推動社會進步、方便人民群眾的生活方面發(fā)揮了巨大作用，但同時這些化學(xué)藥品在生產(chǎn)環(huán)節(jié)以及隨后的運輸、使用、廢棄過程中都不可避免地會進入到環(huán)境而產(chǎn)生可能的環(huán)境污染。關(guān)于化學(xué)污染物的分類因

昆明理工大學(xué)博士學(xué)位論文20光顯微鏡可獲得樣品細胞活性的圖像信息,可以定性觀察，也可以定量分析，由于不依賴下游事件，短時間內(nèi)收集圖像信息，干擾少，假陽性率較低，而且熒光檢測非常敏感，因此不僅能檢測純化合物的活性，也能在提取物中靈敏快速地發(fā)現(xiàn)微量活性物質(zhì)，假陰性率較低，檢測結(jié)果可作為活性導(dǎo)向分離的依據(jù)，能顯著提高發(fā)現(xiàn)活性化合物的效率（圖1.4）。圖1.4利用熒光標(biāo)記GPCRs的檢測和篩選平臺Fig.1.4ThedetectionandScreeningplatformbasedonGFPlabeledGPCRs總之，受體及其效應(yīng)復(fù)合體的熒光成像高內(nèi)涵篩選技術(shù)的創(chuàng)立使得我們能夠從疾病基因相關(guān)調(diào)控通路和信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)水平上研究藥物的作用機制、代謝途徑等，使在在細胞水平上可以全面評價化合物的生物效應(yīng)。能夠進行靈敏、準(zhǔn)確的高內(nèi)涵靶向活性檢測，能對天然藥物的粗提取物進行直接檢測，降低假陰性率，提高成功率，克服了先分離再檢測活性的傳統(tǒng)檢測和篩選模式的弊端。該技術(shù)可以在復(fù)方、天然藥物粗提物、有效部位、有效成分等篩選中發(fā)揮很大的作用，該技術(shù)還具備高通量的能力，非常符合云藥產(chǎn)業(yè)以中藥、天然藥物為主的新藥研發(fā)需求。1.5研究內(nèi)容與技術(shù)路線1.5.1研究內(nèi)容1）以雌激素受體Ea、人糖尿病胰高血糖素1受體（Glucagon-likepeptide1Receptor，GLP1receptor）和心血管疾病相關(guān)嘌呤受體Y1（Purinergicreceptor）三個GPCR家族的受體為材料構(gòu)建熒光標(biāo)記細胞模型。2）建立三個細胞模型的高內(nèi)涵檢測和篩選體系，實現(xiàn)自動化、可視化和定性、定量分

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3102190