慢性疼痛是全球范圍內(nèi)長期致疾的主要原因之一,給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。其中神經(jīng)病理性疼痛是最常見的一種慢性疼痛,在人群中的發(fā)病率高達(dá)7%-10%。目前,神經(jīng)病理性疼痛治療指南推薦的藥物只能對部分患者有效,而且患者常因藥物難以耐受的副作用而停藥。因此,神經(jīng)病理性疼痛的治療仍然是臨床的難點,究其原因主要是發(fā)病機(jī)制尚不清楚。我們亟需解析神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制,尋找有效的干預(yù)手段和藥物作用靶點。神經(jīng)損傷后大腦多個區(qū)域的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,但在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生中的作用尚待研究。在本研究中,我們利用在體神經(jīng)元記錄、鈣信號光纖記錄、光遺傳學(xué)、化學(xué)遺傳學(xué)、逆向跨單突觸追蹤和經(jīng)典藥理學(xué)等多種方法,研究中扣帶皮層Cg2（midcingulate cortex area 2,MCC Cg2）的谷氨酸能神經(jīng)元(MCC Cg2^Glu)在神經(jīng)病理性疼痛中的作用及環(huán)路機(jī)制。我們首先明確MCC Cg2^Glu是否與疼痛有關(guān)。通過在體神經(jīng)元記錄結(jié)合光纖鈣信號記錄技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)疼痛刺激可抑制大多數(shù)的MCC Cg2^Glu的神經(jīng)元活性,表明MCC Cg2

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

麻醉狀態(tài)下,傷害性刺激抑制中扣帶皮層Cg2谷氨酸能神經(jīng)元活動

神經(jīng)元的放電不穩(wěn)定,清醒狀態(tài)下給予傷害性機(jī)械刺激會引起小鼠的躲避反應(yīng),影響并干擾神經(jīng)元的放電。因此在體電生理記錄需要在麻醉條件下記錄每個神經(jīng)元的反應(yīng)�？紤]到麻醉狀態(tài)下可能會影響神經(jīng)元對外界刺激的反應(yīng),我們采用鈣信號記錄觀察清醒狀態(tài)下神經(jīng)元的鈣信號活動變化。為了進(jìn)一步觀察整個MCC Cg2Glu對傷害性刺激的反應(yīng),我們觀察了自由活動小鼠在疼痛發(fā)生時MCC Cg2一群谷氨酸能神經(jīng)元的鈣信號變化。通過立體定位手術(shù)將p AOV-Ca MKIIα-GCAMP6s-e YFP病毒注入到MCC Cg2中(Fig.2A)。免疫組化實驗發(fā)現(xiàn),GCa MP6s-e YFP與谷氨酸能神經(jīng)元標(biāo)記物Ca MKIIα共定位,證明病毒特異性表達(dá)在谷氨酸能神經(jīng)元上(Fig.2B)。我們用鈣信號光纖記錄系統(tǒng)實時監(jiān)測清醒狀態(tài)下MCC Cg2Glu的神經(jīng)元群體的活動,發(fā)現(xiàn)傷害性pinch刺激立即引起小鼠的撤足反應(yīng),但未檢測到明顯的神經(jīng)元鈣信號變化。考慮到傷害性pinch刺激立即引起防御反應(yīng)導(dǎo)致刺激太短暫,不利于觀察神經(jīng)元群體鈣信號的變化,我們進(jìn)一步在福爾馬林引起的持續(xù)性疼痛狀態(tài)下觀察MCC Cg2Glu的鈣信號變化。我們發(fā)現(xiàn)20μL 2%福爾馬林溶液注射于小鼠右側(cè)后爪背部后,左側(cè)MCC Cg2谷氨酸能神經(jīng)元的鈣信號顯著降低,而注射生理鹽水后沒有觀察到鈣信號的變化。福爾馬林引起鈣信號的下降是持久的,并且在1 h觀察結(jié)束時鈣信號沒有恢復(fù)到基線水平(Fig.2C and D)。我們還采用在體單細(xì)胞記錄方法,記錄在福爾馬林溶液引起持續(xù)性疼痛時MCC Cg2Glu的神經(jīng)元活動變化。與鈣信號光纖記錄的結(jié)果一致,注射福爾馬林溶液后,這些神經(jīng)元的平均放電頻率持續(xù)下降(Fig.2E)。以上結(jié)果進(jìn)一步表明在持續(xù)性疼痛過程中,MCC Cg2Glu的神經(jīng)元活性降低。3.2 選擇性激活中扣帶皮層Cg2 谷氨酸能神經(jīng)元抑制機(jī)械性傷害感受

行為學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與不給光對照組相比,藍(lán)光特異性激活MCC Cg2Glu顯著抬高了機(jī)械性PWT(Fig.3D)和機(jī)械性PWL(Fig.3E),表明激活MCC Cg2Glu可抑制雙側(cè)后爪的機(jī)械性傷害感受。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)藍(lán)光刺激和測試左右側(cè)后爪之間沒有相互作用。我們采用熱板和Hargreaves實驗進(jìn)一步研究激活MCC Cg2Glu對熱傷害感受的影響。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)激活MCC Cg2Glu不改變熱板(Fig.3F)和Hargreaves測試的PWL(Fig.3F and G)。我們也觀察了用不同頻率的藍(lán)光激活MCC Cg2Glu對傷害性感受的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),藍(lán)光激活MCC Cg2Glu能夠頻率依賴地抑制機(jī)械性傷害感受,而不同頻率藍(lán)光均不影響熱傷害感受(Fig.4A-C)。雖然20 Hz與10 Hz藍(lán)光激活MCC Cg2Glu都能抬高雙側(cè)后爪的機(jī)械性PWT和PWL,但20Hz會在少數(shù)動物中誘發(fā)癲癇發(fā)作。所以我們在此后的實驗中采用10 Hz作為藍(lán)光刺激頻率。此外,藍(lán)光激活MCC Cg2Glu還能顯著減少對側(cè)后爪在福爾馬林實驗第二相中疼痛反應(yīng)的持續(xù)時間,表明具有抑制炎性疼痛的作用(Fig.3H)。以上結(jié)果表明,激活MCC Cg2Glu負(fù)性調(diào)控疼痛感受,且具有傷害刺激模式依賴性。圖4 藍(lán)光激活中扣帶皮層Cg2谷氨酸能神經(jīng)元頻率依賴性地抑制機(jī)械性傷害感受


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