本文關(guān)鍵詞：白蘞素對卵巢癌遷移和侵襲的影響及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：卵巢癌是美國女性中第五大癌癥死亡病因。大約25%被診斷為局限于一側(cè)或雙側(cè)卵巢疾病的女性,其5年存活率較高(75%-90%)；然而,對于75%被診斷為Ⅲ和Ⅳ期卵巢癌的女性,其長期無病生存的可能性很低(15%-20%)。卵巢癌分兩種截然不同的Ⅰ型和Ⅱ型,卵巢癌最初被認(rèn)為是起源于卵巢表面上皮。Ⅰ型卵巢癌(透明細(xì)胞癌、粘液性癌和低級的漿液性和子宮內(nèi)膜癌)在診斷時(shí)通常局限于卵巢,由交界腫瘤前體發(fā)展而來,且其典型的體細(xì)胞突變基因相對穩(wěn)定,包括KRAS, BRAF, PIK3CA, ErbB2除了TP53。Ⅱ型卵巢癌(高級漿液、高級子宮內(nèi)膜樣、惡性中胚葉混合腫瘤以及未分化癌)惡性程度越高,更具侵襲性,認(rèn)為是由輸卵管上皮癌發(fā)展而來,且基因不穩(wěn)定以體細(xì)胞TP53突變?yōu)樘卣?但Ⅰ型腫瘤很少出現(xiàn)突變特征。先前數(shù)據(jù)也表明,卵巢癌發(fā)病機(jī)理可能依賴于卵巢表面上皮內(nèi)的炎癥反應(yīng)�！安粩嗯怕选钡牟∫蚣僬f(增加一生排卵的時(shí)間與卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān))支持了這一假設(shè)。排卵可導(dǎo)致卵巢表面上皮重復(fù)創(chuàng)傷,需要通過招募白細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子、釋放一氧化二氮、DNA修復(fù)、組織重組等介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)修復(fù)。重組可導(dǎo)致上皮細(xì)胞被困在包涵囊腫內(nèi)部,局部微環(huán)境似乎可誘導(dǎo)獲得類腫瘤生成的特征如p53積聚和較表面上皮細(xì)胞增加九倍的增殖指數(shù)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是最初見于胚胎發(fā)生的過程,可引起間葉細(xì)胞的產(chǎn)生。上皮細(xì)胞經(jīng)過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化后可遷移到細(xì)胞外環(huán)境以及定居在新器官。近年來,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化樣過程被認(rèn)為是決定腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的重要步驟。目前腫瘤進(jìn)展的研究表明,在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中,腫瘤細(xì)胞喪失本身上皮樣特點(diǎn)而獲得某種間葉細(xì)胞的特性,從而促進(jìn)對細(xì)胞外基質(zhì)的侵襲以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。被EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子負(fù)性調(diào)節(jié)的細(xì)胞靶點(diǎn)之一就是E-鈣粘蛋白,是經(jīng)典鈣粘蛋白家族的原型成員。核因子kappaB(NF-xB)指的是一類轉(zhuǎn)錄因子家族(也被稱為Rel家族),調(diào)節(jié)超過400個(gè)基因的表達(dá)。這些調(diào)節(jié)的基因在許多細(xì)胞過程中是至關(guān)重要,其中包括多種細(xì)胞因子、趨化因子、促炎基因、粘附分子、急性期反應(yīng)蛋白、補(bǔ)充因子、應(yīng)激反應(yīng)基因、氧化酶、細(xì)胞凋亡基因、生長因子和其他轉(zhuǎn)錄因子等。由于這一調(diào)節(jié)作用,NF-κB被認(rèn)為與幾種疾病有關(guān),包括心血管疾病和各種癌癥。證據(jù)表明NF-κ在許多腫瘤細(xì)胞系中組成型激活,從而影響腫瘤的進(jìn)展和對化療的反應(yīng)NF-κB介導(dǎo)的信號通路可通過抑制凋亡、血管的生成、增殖和炎癥等腫瘤的特征來促進(jìn)生存。卵巢腫瘤可以獲得增強(qiáng)NF-κB功能,來回避凋亡通路和抵抗外界環(huán)境的傷害,如抗腫瘤免疫效應(yīng)物或化療。在體外或人類細(xì)胞系異種移植中NF-κB活性的抑制可增加細(xì)胞對順鉑和紫杉醇誘導(dǎo)凋亡的敏感性,而鉑類聯(lián)合紫杉醇是最常用的卵巢癌的一線治療。腫瘤壞死因子-α(TNFa)可引起細(xì)胞的凋亡,然而,卵巢癌之所以產(chǎn)生細(xì)胞耐受,主要是癌細(xì)胞可以上調(diào)信號通路引起NF-κB激活和引發(fā)凋亡抑制蛋白的產(chǎn)生。除了在腫瘤細(xì)胞中的直接作用外,NF-κB介導(dǎo)的事件也可導(dǎo)致與卵巢癌相關(guān)微環(huán)境和腹膜炎癥的發(fā)生。NF-κB在炎癥中的核心作用已引起了廣泛的關(guān)注,因?yàn)榭鼓[瘤免疫反應(yīng)能改善患者的預(yù)后。卵巢腫瘤被各種免疫效應(yīng)器浸潤,包括抗腫瘤T細(xì)胞。免疫浸潤的類型可影響疾病的進(jìn)展.趨化因子及細(xì)胞因子控制抗腫瘤免疫反應(yīng)類型,這些細(xì)胞因子由浸潤腫瘤的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和腫瘤本身產(chǎn)生。所有這些NF-κB的功能似乎均在卵巢癌中發(fā)揮作用,因此進(jìn)一步了解NF-κB介導(dǎo)的生物學(xué)活動(dòng)能更好地識(shí)別女性患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn),從而促進(jìn)發(fā)現(xiàn)更有效的治療策略。大量證據(jù)支持NF-κB在卵巢癌細(xì)胞和抗腫瘤免疫反應(yīng)中的重要性,因此我們可假設(shè)此炎癥相關(guān)癌癥的原因不明的風(fēng)險(xiǎn)是由于NF-κB通路中的基因變異導(dǎo)致的。文獻(xiàn)報(bào)道,NF-KB/Snail通過調(diào)控EMT,參與乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲過程白蘞素(3,5,7,3’、4’、5’-六羥基2,3二氫黃酮醇,AMPLS)是一種最常見的從顯齒蛇葡萄類植物(稱為藤茶)的嫩莖和嫩葉中分離出的類黃醇。AMPLS不溶于水(0.67 mM 25℃)和含水或有機(jī)的溶劑,AMPLS暴露在光線下容易分解,形成一個(gè)彩色的光解產(chǎn)品。低水溶性、低腸道通透性低和易于在溶液中降解等特點(diǎn)限制了AMPLS在大多數(shù)藥物制劑和作為實(shí)驗(yàn)化合物的潛能。白蘞素具有許多藥理活性,如抗炎抗菌活性、減輕咳嗽以及抗氧化、降壓、保肝和抗癌的效果。最近的一項(xiàng)研究報(bào)道了AMPLS抗人類免疫缺陷病毒(HIV)及其與HIV-1受體趨化因子受體CXCR4的作用。AMPLS的抗病毒作用可能與其抗氧化屬性相關(guān)。AMPLS抑制體外黑色素瘤細(xì)胞的生長和侵襲并抑制體內(nèi)黑色素瘤的轉(zhuǎn)移。AMPLS通過體內(nèi)抑制癌細(xì)胞增殖來抑制肺癌的生長。AMPLS通過抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和基本纖維母細(xì)胞生長因子(bFGF)的分泌產(chǎn)生抗血管生成活性。AMPLS通過減少p糖蛋白的表達(dá)也可逆轉(zhuǎn)體外白血病細(xì)胞多藥耐藥性。AMPLS在多種腫瘤細(xì)胞中被證實(shí)具有抗癌活性。推測白蘞素對卵巢癌有一定作用并尋找可能機(jī)制,為卵巢癌治療提供新思路。因此,本研究的主要目的在于研究白蘞素對卵巢癌發(fā)生的影響及其可能的信號通路機(jī)制。研究目的1.探討白蘞素對卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響；2.探討白蘞素對上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換的影響；3.探討白蘞素對卵巢癌的影響及其相關(guān)信號通路。研究方法：1.細(xì)胞培養(yǎng)A2780細(xì)胞系,即人卵巢癌細(xì)胞系,購買于美國種質(zhì)保藏中心,由包括10%胎牛血清的RPMI1640于37攝氏度、5%C02孵箱里培育。2.MTT實(shí)驗(yàn)將A2780細(xì)胞以5000個(gè)／孔的密度接種于96孔板,用白蘞素以不同濃度和不同時(shí)間點(diǎn)刺激細(xì)胞后,MTT(5 mg/ml,20μl)加孔中并孵育4h,再放入80μlDMSO孵育15分鐘。取490nm波長,微型板塊光度計(jì)測量每個(gè)孔光吸收數(shù)值。3.刮傷愈合實(shí)驗(yàn)A2780細(xì)胞以1×106/孔密度培養(yǎng)于6孔板,用吸管以相同寬度的直線劃過A2780單層細(xì)胞,與25μm白蘞素孵化后24 h,顯微鏡下拍照、測量、分析。4. Transwell實(shí)驗(yàn)將A2780細(xì)胞接種于24孔板內(nèi),上室為含1%胎牛血清RPMI1640,下室為含10%胎牛血清RPMI1640。細(xì)胞(1x105／孔)放上室于37℃、5%C02的孵箱中培育,24小時(shí)后,下層的細(xì)胞甲醇固定30分鐘再用結(jié)晶紫染色,上層拭去。5. Western Blot檢測刺激后,采集A2780cell并裂解,試劑盒測蛋白濃度,用特異性抗體測定E-cadherin, N-cadherin的表達(dá),以及波形蛋白,GAPDH, NF-κB, p-IkBa, Snail.并用Photoshop軟件進(jìn)行條帶灰度分析。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用預(yù)測分析軟件(PASW)統(tǒng)計(jì)18.0。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用單因素方差分析,非參數(shù)變量用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析。P0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1.白蘞素抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖以0,5,10,25,50μM濃度的白蘞素刺激A2780細(xì)胞,在以50μM的白蘞素孵育24h后,細(xì)胞增殖顯著受抑制；以低于50μM的白蘞素孵育,抑制效果并不明顯。而后分別以25μM和50μM的白蘞素在不同時(shí)間點(diǎn)(Oh, 1h,3h,6h,12h,24h and 48h)刺激A2780細(xì)胞,50μM的白蘞素刺激24h后可顯著抑制細(xì)胞增殖,而25μM的白蘞素在刺激48h后并不能抑制細(xì)胞增殖。2.白蘞素抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲傷口愈合實(shí)驗(yàn)中,白蘞素刺激后劃痕距離較未加刺激寬,表明白蘞素可抑制A2780細(xì)胞的遷移。Transwell實(shí)驗(yàn)中,白蘞素刺激后由上室侵襲到下室的細(xì)胞明顯減少,表明白蘞素可抑制A2780細(xì)胞的侵襲。3.白蘞素濃度依賴方式改變卵巢癌細(xì)胞中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)標(biāo)記物表達(dá)以不同濃度(5,10,25 and 50μM)刺激卵巢癌細(xì)胞,而后繼續(xù)孵育12h。結(jié)果表明,白蘞素可顯著增加上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)以及降低間充質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)。這一結(jié)果表明,白蘞素可以濃度依賴的方式改變EMT標(biāo)志物的表達(dá),從而提示我們白蘞素對A2780細(xì)胞遷移和侵襲的影響或許與EMT有關(guān)。4.白蘞素抗轉(zhuǎn)移機(jī)制與NF-κB通路有關(guān)以不同濃度(5,10,25 and 50μM)白蘞素刺激12h,分別提取細(xì)胞漿和細(xì)胞核中的蛋白,檢測P65和IκBα的表達(dá)。細(xì)胞漿中p65的表達(dá)顯著增加而細(xì)胞核中表達(dá)下降。同時(shí),細(xì)胞漿中iκBα的磷酸化在白蘞素刺激后下降。在加入白蘞素前,用NF-κB通路抑制劑BAY11-7082(20μM)預(yù)處理2小時(shí)。結(jié)果顯示,BAY 11-7082顯著逆轉(zhuǎn)白蘞素誘導(dǎo)的E-鈣黏蛋白的增加及N-鈣黏蛋白和波形蛋白的下降。5.白蘞素通過NF-κB激活誘導(dǎo)Snail上調(diào)以濃度梯度(5,10,25 and 50μM)的白蘞素刺激卵巢癌細(xì)胞24h。結(jié)果顯示,白蘞素隨濃度增加能明顯抑制Snail的表達(dá),在濃度為50μM的達(dá)到最大活性。BAY11-7082(20nM)預(yù)處理2h可顯著消除白蘞素的抑制性影響。以上結(jié)果表明,NF-κB是Snail的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者,白蘞素至少部分是通過抑制NF-κB通路抑制Snail的表達(dá)。結(jié)論1.白蘞素可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；2.白蘞素的抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性；3.白蘞素可以濃度依賴的方式改變EMT標(biāo)志物的表達(dá)；4.白蘞素通過NF-κB信號通路誘導(dǎo)Snail的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：卵巢癌 白蘞素 遷移與侵襲 NF-κB Snail
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 符號說明17-18
• 前言18-21
• 材料和方法21-27
• 結(jié)果27-29
• 討論29-43
• 結(jié)論43-44
• 附表和附圖44-51
• 參考文獻(xiàn)51-62
• 致謝62-63
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄63-64
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況64-65
• 外文論文65-93

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 鄭宏強(qiáng),劉德育;蛇葡萄素抗黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用[J];癌癥;2003年04期

2 張友勝,寧正祥,楊書珍,吳暉;顯齒蛇葡萄中二氫楊梅樹皮素的抗氧化作用及其機(jī)制(英文)[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2003年04期

  本文關(guān)鍵詞：白蘞素對卵巢癌遷移和侵襲的影響及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：264388