本文關(guān)鍵詞：黑根霉菌絲體多糖結(jié)構(gòu)表征及其抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類生命健康,已成為人類最主要的致死疾病之一。據(jù)全國腫瘤防治研究辦公室的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,我國每年新發(fā)癌癥病例為350萬,因癌癥死亡的有250萬�；瘜W(xué)療法是目前治療癌癥的重要手段之一,但是臨床上的化療藥物在殺死癌細(xì)胞的同時也損傷了機(jī)體正常細(xì)胞的功能,導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用,降低了患者的生存質(zhì)量。此外,癌細(xì)胞對化療藥物易產(chǎn)生耐藥性,常常導(dǎo)致化療失敗。因此,迫切需要尋找高效、低毒的新型腫瘤治療藥物。大量研究表明,多糖具有廣泛的藥理學(xué)活性,包括抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老等。其中,多糖的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性研究受到越來越多的關(guān)注。多糖主要從兩個方面發(fā)揮抗腫瘤作用：作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑激活機(jī)體的免疫反應(yīng)間接發(fā)揮抗腫瘤活性；通過引起細(xì)胞應(yīng)激,調(diào)控腫瘤細(xì)胞中癌基因表達(dá)等誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡、細(xì)胞周期阻滯,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,發(fā)揮直接抗腫瘤作用。黑根霉Rhizopus nigricans是一種接合菌門絲狀真菌,具有優(yōu)異的生物轉(zhuǎn)化功能,被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)。研究發(fā)現(xiàn),通過液體發(fā)酵獲得的黑根霉菌絲體中含有大量活性多糖組分,具有良好的藥理活性。本文以實(shí)驗(yàn)室分離保藏的一株黑根霉為材料,從其液體發(fā)酵菌絲中分離純化活性多糖組分,研究其結(jié)構(gòu)特征、抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)活性。以上研究旨在闡明黑根霉菌絲體多糖抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)活性的分子機(jī)制,為將其開發(fā)成為一種治療或輔助治療癌癥的藥物奠定基礎(chǔ)。1.黑根霉菌絲體多糖的制備和結(jié)構(gòu)表征采用水熱浸提、乙醇沉淀、Sevag脫蛋白、D301R大孔樹脂脫色,從黑根霉菌絲體中獲得粗多糖。經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱層析,從粗多糖中分離獲得黑根霉菌絲體多糖RPS,RPS的單糖組成和摩爾比為甘露糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：巖藻糖=5.1：1.0：1.6：92.2：1.3：2.3。另外,采用DEAE-Sepharos Fast Flow陰離子交換凝膠層析和Sephacryl S-500 HR分子篩凝膠層析從粗多糖中分離純化獲得一種均一的水溶性非淀粉多糖,命名為RPS-1。高效尺寸排阻色譜聯(lián)用多角度激光散射分析表明RPS-1的重均分子量為1.617×107g/mol,多分散系數(shù)為1.332,均方根旋轉(zhuǎn)半徑為24.2 nm。紅外光譜結(jié)果顯示RPS-1具有多糖的特征吸收峰。PMP柱前衍生化方法分析RPS-1的單糖組成,結(jié)果顯示RPS-1只含有葡萄糖一種單糖。甲基化分析結(jié)果表明,RPS-1糖鏈中含有α-Glcp-(1→ α-Glcp-(1→和→4)--Glcp-(1→三種連接方式,摩爾比例為6.9：86.1：6.9。1HNMR核磁共振譜圖的異頭質(zhì)子信號區(qū)域顯示兩個共振峰,δ5.35 ppm和4.92ppm分別歸屬為→4)-α-Glcp-(1→和α-Glcp-(1→的異頭碳質(zhì)子信號。13C NMR核磁共振譜圖中,δ99.86 ppm為→4)-α-Glcp-(1→的C-1共振峰,且位于α-型糖苷異頭碳的共振信號范圍內(nèi)。δ76.95 ppm為發(fā)生取代的C-4共振峰,δ60.58 ppm是葡萄糖殘基的未取代的C-6共振峰,δ69.43 ppm是葡萄糖殘基發(fā)生取代的C-6共振峰。根據(jù)以上結(jié)果我們推斷,RPS-1是以→4)-α-D-Glcp(1→為主鏈并在其O-6位產(chǎn)生支鏈的非淀粉葡聚糖,平均每14.5個葡萄糖出現(xiàn)1個→4,6)-α-Glcp-(1→殘基。2.黑根霉菌絲體多糖RPS的抗腫瘤活性研究多糖具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)和多樣的生物活性,可以在體外直接作用于腫瘤細(xì)胞,干擾細(xì)胞的新陳代謝、抑制其分裂增殖。本文研究了RPS對人胃癌BGC-823細(xì)胞的抗腫瘤活性,并初步探討了其可能的作用機(jī)制。MTT結(jié)果顯示,RPS處理12h、24、48h可以顯著抑制BGC-823細(xì)胞生長。集落克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,600μg/ml的RPS可以顯著抑制BGC-823細(xì)胞集落形成,抑制率為70%。Hoechst33258染色、AO/EB染色和AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,RPS誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞發(fā)生凋亡性細(xì)胞死亡。細(xì)胞周期分布檢測結(jié)果顯示,RPS可以阻滯腫瘤細(xì)胞于G2/M期。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),RPS可以誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞線粒體膜電位的下降,提高細(xì)胞內(nèi)活性氧含量。Caspase-9是線粒體凋亡通路的關(guān)鍵蛋白酶,位于線粒體通路中caspase瀑布式級聯(lián)激活反應(yīng)的頂端,600 μg/ml濃度的RPS處理組的caspase-9活性是對照組的1.72倍。PCR檢測結(jié)果顯示,RPS處理12h后,Bcl-2的nRNA的表達(dá)量隨著RPS濃度的升高不斷降低,然而Bax的mRNA表達(dá)量隨著RPS濃度的升高不斷增加。這些結(jié)果表明,RPS通過線粒體途徑誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細(xì)胞發(fā)生凋亡。我們還發(fā)現(xiàn),RPS可以提高BGC-823細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度,上調(diào)GRP78、ATF6、CHOP和spliced-XBP1的mRNA表達(dá)水平,表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能也參與了RPS誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞凋亡。3.黑根霉菌絲體多糖RPS-1的免疫調(diào)節(jié)活性研究巨噬細(xì)胞是最重要的吞噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞之一,在機(jī)體免疫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。因此,本文選擇小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7為材料,研究RPS-1的免疫調(diào)節(jié)活性。MTT檢測結(jié)果表明,RPS-1在25-800 μg/ml濃度范圍內(nèi)對巨噬細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。采用Griess法和ELISA分別測定NO和TNF-a的含量,結(jié)果表明RPS-1能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO和TNF-a,流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明RPS-1可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力。。PMB可以特異性和內(nèi)毒素結(jié)合,阻斷其對巨噬細(xì)胞的刺激作用。PMB預(yù)處理不影響RPS-1刺激巨噬細(xì)胞分泌NO和TNF-a,說明RPS-1中不含內(nèi)毒素污染。為了探明RPS-1激活巨噬細(xì)胞的信號通路和分子機(jī)制,我們采用免疫熒光染色、熒光素酶報告基因檢測和western blot檢測細(xì)胞內(nèi)NF-κB、MAPk、Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RPS-1可以時間依賴性的誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)IκBα的降解和NF-κB p65的核移位,濃度依賴性的提高NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。使用NF-κB通路特異性抑制劑BAY11-7082 (10μM)幾乎完全抑制RPS-1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌NO和TNF-a,表明NF-kB是參與RPS-1激活巨噬細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子。我們還發(fā)現(xiàn),RPS-1提高了p38、JNK、ERK和Akt的磷酸化水平。MAPK通路抑制劑PD98059(30μM)、SP600125(20μM)以及PI3K/Akt通路抑制劑LY294002(50μM)可以不同程度的抑制RPS-1誘導(dǎo)的NO和TNF-α分泌,然而p38通路抑制劑SB203580 (10μM)對RPS-1誘導(dǎo)的NO分泌沒有影響。在不同的細(xì)胞類型和刺激因素下,MAPK通路和PBK/Akt通路之間存在著復(fù)雜的相互作用。我們發(fā)現(xiàn),MAPK抑制劑預(yù)處理巨噬細(xì)胞30min后,RPS-1誘導(dǎo)的Akt磷酸化水平出現(xiàn)不同程度的下降,PBK/Akt抑制劑LY294002預(yù)處理可以明顯降低JNK的磷酸化水平,但是對p38和ERK的磷酸化水平?jīng)]有明顯的影響,表明p-JNK和p-Akt在RPS-1激活巨噬細(xì)胞過程中存在著交互作用。RPS-1可以提高CT26結(jié)腸癌荷瘤小鼠的免疫器官指數(shù)、血清細(xì)胞因子含量和CD8+T淋巴細(xì)胞比例,抑制腫瘤生長,和5-FU聯(lián)用還具有減毒增效的作用。綜上所述,黑根霉菌絲體多糖RPS通過誘導(dǎo)線粒體途徑細(xì)胞凋亡和G2/M期阻滯抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖；黑根霉菌絲體多糖RPS-1是以→4)-α-D-Glcp(1→為主鏈并在其O-6位產(chǎn)生支鏈的非淀粉葡聚糖,可以通過NF-κB、MAPK和PI3K/Akt通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO和TNF-α,提高CT26結(jié)腸癌荷瘤小鼠的免疫功能,抑制移植瘤生長,和5-FU聯(lián)用還具有減毒增效的作用。
【關(guān)鍵詞】：黑根霉 菌絲體多糖 結(jié)構(gòu)表征 抗腫瘤 免疫調(diào)節(jié)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R284;R285
【目錄】：

• 摘要16-19
• Abstract19-24
• 本文縮略詞24-26
• 第一章 緒論26-54
• 1. 多糖的免疫調(diào)節(jié)作用27-34
• 1.1 多糖對免疫器官的作用27-28
• 1.2 多糖對免疫細(xì)胞的作用28-30
• 1.2.1 多糖對巨噬細(xì)胞的作用28-29
• 1.2.2 多糖對淋巴細(xì)胞的作用29
• 1.2.3 多糖對樹突狀細(xì)胞的作用29-30
• 1.3 多糖受體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)30-34
• 1.3.1 Toll-like受體31-32
• 1.3.2 補(bǔ)體受體332
• 1.3.3 Dectin-1受體32-33
• 1.3.4 清道夫受體33
• 1.3.5 甘露糖受體33-34
• 2. 多糖的直接抗腫瘤作用34-41
• 2.1 多糖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡34-38
• 2.2 多糖改變細(xì)胞膜的生化特性38-39
• 2.3 多糖抑制腫瘤轉(zhuǎn)移39-41
• 2.4 多糖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯41
• 3. 多糖的構(gòu)效關(guān)系41-43
• 4. 多糖的研究方法43-52
• 4.1 多糖提取44-46
• 4.1.1 溶劑浸提法44
• 4.1.2 酶法提取44-45
• 4.1.3 微波和超聲波輔助提取45
• 4.1.4 超高壓提取法45
• 4.1.5 超臨界萃取技術(shù)45-46
• 4.2 多糖分離純化46-49
• 4.2.1 多糖的分離46-47
• 4.2.2 多糖的純化47-49
• 4.3 多糖結(jié)構(gòu)表征49-52
• 4.3.1 多糖純度測定49
• 4.3.2 多糖分子量和分子尺寸49-50
• 4.3.3 單糖組成測定50
• 4.3.4 糖鏈結(jié)構(gòu)的分析方法50-52
• 5. 本課題研究目的和意義52-54
• 第二章 黑根霉菌絲體多糖的制備和結(jié)構(gòu)表征54-71
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料與儀器54-56
• 1.1 菌株54
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑54-55
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器55-56
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法56-60
• 2.1 黑根霉的培養(yǎng)56
• 2.2 黑根霉菌絲體多糖的制備56-57
• 2.3 理化性質(zhì)分析57-58
• 2.3.1 碘-碘化鉀反應(yīng)57
• 2.3.2 總糖含量的測定57
• 2.3.3 紫外檢測57-58
• 2.4 高效尺寸排阻色譜聯(lián)合多角度激光光散射分析58
• 2.5 單糖組成分析58-59
• 2.5.1 多糖水解58
• 2.5.2 柱前衍生條件58-59
• 2.5.3 色譜條件59
• 2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制59
• 2.6 紅外光譜分析59
• 2.7 甲基化分析59-60
• 2.8 核磁共振波譜分析60
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析60-70
• 3.1 黑根霉菌絲體多糖的制備60-62
• 3.2 黑根霉菌絲體多糖的理化性質(zhì)分析62
• 3.3 黑根霉菌絲體多糖的單糖組成分析62-64
• 3.4 黑根霉菌絲體多糖的高效尺寸排阻色譜-多角度激光散射分析64-65
• 3.5 黑根霉菌絲體多糖的紅外光譜測定結(jié)果65-66
• 3.6 黑根霉菌絲體多糖的甲基化分析66-69
• 3.7 黑根霉菌絲體多糖的核磁共振分析結(jié)果69-70
• 4. 小結(jié)70-71
• 第三章 黑根霉菌絲體多糖RPS的抗腫瘤活性研究71-88
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料與儀器72-73
• 1.1 細(xì)胞株72
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑72-73
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器73
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法73-79
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)73-74
• 2.2 細(xì)胞增殖活性檢測74
• 2.3 細(xì)胞周期檢測74
• 2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察74-75
• 2.4.1 AO/EB染色74
• 2.4.2 Hoechst 33258染色74-75
• 2.5 細(xì)胞凋亡檢測75
• 2.6 線粒體膜電位檢測75-76
• 2.7 活性氧檢測76
• 2.8 鈣離子濃度檢測76
• 2.9 基因表達(dá)檢測76-79
• 2.9.1 總RNA的提取76-77
• 2.9.2 cDNA的合成77
• 2.9.3 引物的設(shè)計77-78
• 2.9.4 PCR和實(shí)時熒光定量PCR分析78-79
• 2.10 統(tǒng)計學(xué)處理79
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析79-87
• 3.1 RPS的體外抗腫瘤活性篩選79-80
• 3.2 RPS誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞發(fā)生G2/M期周期阻滯80-81
• 3.3 RPS誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑凋亡81-85
• 3.3.1 RPS對BGC-823細(xì)胞凋亡的影響81-83
• 3.3.2 RPS誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞線粒體膜電位下降83-84
• 3.3.3 RPS提高BGC-823細(xì)胞內(nèi)活性氧含量和游離鈣離子濃度84
• 3.3.4 RPS激活BGC-823細(xì)胞內(nèi)caspase-9和caspase-384-85
• 3.3.5 RPS對Bcl-2和Bax基因表達(dá)的影響85
• 3.4 RPS誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激85-87
• 4. 小結(jié)87-88
• 第四章 黑根霉菌絲體多糖RPS-1的免疫調(diào)節(jié)活性研究88-111
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料與儀器88-91
• 1.1 細(xì)胞株88-89
• 1.2 實(shí)驗(yàn)動物89
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑89-90
• 1.4 實(shí)驗(yàn)儀器90-91
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法91-97
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)91
• 2.2 細(xì)胞增殖活力檢測91
• 2.3 吞噬能力檢測91
• 2.4 一氧化氮測定91
• 2.5 酶聯(lián)免疫吸附法測定細(xì)胞因子含量91-92
• 2.6 蛋白提取92-93
• 2.6.1 細(xì)胞總蛋白提取92
• 2.6.2 細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白提取92-93
• 2.7 免疫印跡93
• 2.8 熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)93-96
• 2.8.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和提取93-95
• 2.8.2 基因轉(zhuǎn)染95
• 2.8.3 熒光素酶活性檢測95-96
• 2.9 荷瘤小鼠模型構(gòu)建96
• 2.10 腫瘤抑制率、脾指數(shù)及胸腺指數(shù)的測定96-97
• 2.11 CD8~+T淋巴細(xì)胞分析97
• 2.12 統(tǒng)計學(xué)處理97
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析97-110
• 3.1 RPS-1對RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響97
• 3.2 RPS-1提高RAW 264.7細(xì)胞的吞噬活性97-98
• 3.3 RPS-1促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞分泌一氧化氮和腫瘤壞死因子98-101
• 3.4 RPS-1激活NF-κB、MAPK和PI3K/Akt通路101-104
• 3.5 MAPK、PI3K/Akt和NF-κB通路在RPS-1激活巨噬細(xì)胞過程中發(fā)揮的作用104-105
• 3.6 MAPK和PI3K/Akt通路的相互作用105-106
• 3.7 RPS-1對荷瘤小鼠腫瘤生長、免疫器官指數(shù)和體重的影響106-109
• 3.8 RPS-1對荷瘤小鼠血清中細(xì)胞因子含量的影響109
• 3.9 RPS-1對荷瘤小鼠脾臟中CD8~+T淋巴細(xì)胞比例的影響109-110
• 4. 小結(jié)110-111
• 第五章 討論111-116
• 參考文獻(xiàn)116-131
• 致謝131-132
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文132-133
• 附件133-150
• 附表150

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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  本文關(guān)鍵詞：黑根霉菌絲體多糖結(jié)構(gòu)表征及其抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：259645