本文關鍵詞：PEDF基因在乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用與機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的重要作用及其與腫瘤微環(huán)境之間的相互關系一直是近年來研究熱點。EMT的概念最早在成人和胚胎上皮中發(fā)現(xiàn)了細胞表型和間質(zhì)狀態(tài)等EMT相關的變化,由Garry Greenburg與Elisabeth Hay提出,國外研究發(fā)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化不但參與組織分化和胚胎發(fā)育過程,而且在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移、組織修復、以及器官纖維化過程中發(fā)揮重要作用。除了細胞形態(tài)學上的改變,EMT還可以誘導干細胞特性、阻止自身細胞的凋亡、增強細胞侵襲能力、抗衰老功能、以及誘發(fā)產(chǎn)生免疫抑制等,并能使細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)相關的成分產(chǎn)生增多。在EMT過程中,上皮細胞發(fā)生了一系列生物學改變：如消失極性、喪失胞間聯(lián)系、骨架重塑、游走或上皮細胞表型標志物的表達變化：如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、p-連環(huán)蛋白(p-Catenin)、緊密連接蛋白、細胞角蛋白等的表達缺失和間質(zhì)細胞標志物：如波形蛋白(Vimentin)、纖維連接蛋白、N-鈣黏素(N-Cadherin)等表達增強,從而轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)特點的間質(zhì)樣細胞,這些特征性改變使細胞獲得侵襲或運動表型,因此發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的腫瘤細胞更具有原位侵襲和遠處轉(zhuǎn)移能力、對化療藥物及靶向藥物的敏感性降低。近年來,乳腺癌發(fā)病率不斷提升,雖然治療手段也隨之相應提高,但仍有約25%～35%的病例發(fā)生轉(zhuǎn)移并導致治療失敗。在臨床治療過程中,診斷相同的乳腺癌病例,其臨床預后往往差別很大,造成這種患者預后不同的原因是腫瘤的生物學異質(zhì)性。研究發(fā)現(xiàn)EMT標記物表達在個體和群體水平都與乳腺癌預后不良相關,誘導乳腺上皮細胞發(fā)生EMT后,可以表達腫瘤干細胞表型,并且腫瘤的EMT還與腫瘤化療耐藥相關,促進多藥耐藥基因(multidrug resistance gene 1, MDR1)的表達。研究表明,基底樣表型的乳腺癌細胞可誘發(fā)EMT發(fā)生,包括：Vimentin的上調(diào)、E-caherin向N-Cadherin的表達、細胞骨架重組等；乳腺癌細胞EMT過程與Snail的高表達有關,并且P13K/Akt:這一信號通路在乳腺癌細胞EMT過程中非常重要；研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌組織中,NF-κB p65異常活化,它的高表達與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切關系,在乳腺癌的發(fā)生及惡性進展過程中起著重要的促進作用。色素上皮衍生因子(PEDF、Pigment epithelium-derived factor)是一個能有效抑制新生血管形成的蛋白,PEDF不但作為一個抗血管生成因子來抑制腫瘤的生長,而且外源性或細胞表面的PEDF也直接與細胞外基質(zhì)相互作用來阻止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。最近研究發(fā)現(xiàn)PEDF蛋白可以通過抑制間質(zhì)蛋白水解和形態(tài)學改變來抑制黑色素瘤腫瘤細胞的外滲,表明PEDF也直接與細胞外基質(zhì)相互作用來阻止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移,在腫瘤微環(huán)境中促進了腫瘤細胞的凋亡,導致了內(nèi)皮細胞的凋亡。最新實驗研究表明,PEDF蛋白通過層粘連蛋白受體AKT/ERK通路調(diào)低纖維連接蛋白,來抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移,表明PEDF蛋白可能具有雙重作用來抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移,從而開辟了一條阻止乳腺癌進展的新途徑。國內(nèi)外目前對EMT相關的促進因子、轉(zhuǎn)錄因子均有所研究,尤其是在乳腺癌方面,金屬蛋白酶、miRNA等在調(diào)控EMT方面取得了一定的研究進展,但是尋找一個靶向基因研究其在乳腺癌調(diào)控EMT的方面研究甚少。此研究首次探討PEDF蛋白在乳腺癌中表達與乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關系及其在乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用,與Vimentin、E-cadherin、Snail、NF-κB這幾種蛋白質(zhì)的聯(lián)合檢測利于評估腫瘤的生物學行為及預后,有助于對指導乳腺癌的治療和提高療效。觀察PEDF是否通過介導乳腺癌細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來參與乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移,這一發(fā)現(xiàn)將為乳腺癌尋找新的治療藥物和作用靶點奠定基礎。第一部分PEDF蛋白在乳腺癌中的表達及其與EMT相關性研究研究目的：1.通過對乳腺浸潤性導管癌組織標本中PEDF、Vimentin、E-cadherin、Snail、 NF-κB表達研究,檢測PEDF基因是否參與了乳腺癌組織的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,并檢測與乳腺癌級別、組織臨床病理參數(shù)、分子分型的關系、闡明PEDF基因在乳腺癌EMT中的調(diào)節(jié)作用；研究方法：1.采用免疫組化方法檢測119例原發(fā)性乳腺癌組織和30例癌旁乳腺組織中PEDF基因、間質(zhì)性標記基因Vimentin、上皮性標記基因E-cadherin、轉(zhuǎn)錄因子Snail及NF-κB蛋白的表達,比較乳腺癌組織和正常乳腺組織中這五個指標的表達情況；分析PEDF、E-cadherin、Vimentin、Snail及NF-κB蛋白的表達與乳腺癌臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關性；分析乳腺癌組織中E-cadherin、 Vimentin、Snail及NF-κB蛋白與PEDF蛋白的表達相關性；分析PEDF、 E-cadherin、Vimentin、Snail及NF-κB蛋白與乳腺腺浸潤性導管癌臨床預后的關系；單因素和多因素分析PEDF、Vimentin, E-cadherin、Snail、NF-κB蛋白與臨床病理特征的相關性2.統(tǒng)計學分析：數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0(SPSS, Inc. Chicago, IL, USA)統(tǒng)計軟件。使用t檢驗或方差分析分析PEDF、E-cadherin、Vimentin、Snail及NF-κB蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中的陽性表達率關系,參數(shù)以x±S表示。相關分析采用Pearson或Spearman相關分析法分析分析乳腺癌組織中E-cadherin、 Vimentin、Snail及NF-κB蛋白與PEDF蛋白的表達相關性；分析PEDF、 E-cadherin、Vimentin、Snail及NF-κB蛋白與乳腺腺浸潤性導管癌臨床預后的關系；單因素和多因素分析PEDF、Vimentin、E-cadherin、Snail、NF-κB蛋白與臨床病理特征的相關性。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。實驗結(jié)果1. PEDF、E-cadherin、Vimentin、Snail及NF-κB蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中的陽性表達率分別為44.5%、49.5%、47.9%、57.1%；高表達的PEDF蛋白與低表達E-cadherin蛋白、高表達Snail蛋白、NF-κB蛋白有統(tǒng)計學意義的相關性,其中高表達的PEDF蛋白與低表達E-cadherin蛋白是中等相關,與高表達Snail蛋白、NF-κB蛋白是弱相關(P0.001, r=0.496、r=0.34、r=0.383)。2. PEDF蛋白在浸潤性乳腺癌中的表達與腫瘤大小相關(P=0.039)；而與患者年齡、TNM分期、組織學類型、ER受體、PR受體、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移無關(P=0.809、P=0.240、P=0.113、P=0.862、P=0.137、P=0.555)。Vimentin蛋白在浸潤性乳腺癌中的表達與腫瘤TNM分期、腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、PR受體、組織學類型、有統(tǒng)計學意義(P0.001、P=0.017; P0.001、P=0.008、 P=0.005)而與患者年齡、ER受體相關無統(tǒng)計學意義(P=0.407、P=0.248)。E-cadherin蛋白在浸潤性乳腺癌中的表達與腫瘤大小、TNM分期、PR受體、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關有統(tǒng)計學意義(P=0.004、P0.001、P＝0.014、P=0.013);而與患者年齡、組織學類型、ER受體相關無統(tǒng)計學意義(P=0.929、P=0.126、P=0.314)；Snail蛋白高表達與腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、TNM分期相關有統(tǒng)計學意義(P0.001、P0.001、P=0.001),而與患者年齡、組織學類型、ER受體、PR受體相關無統(tǒng)計學意義(P=0.775、P=0.672、P＝0.348、P=0.111); NF-κB蛋白高表達與腫瘤大小、組織學分級、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀態(tài)、TNM分期相關(P=0.001、P=0.001、P=0.001, P0.001),而與患者年齡、ER受體、PR受體相關無統(tǒng)計學意義(P=0.246、P=0.419、P=0.186)。3.在119例浸潤性導管癌中,應用Spearman相關性分析發(fā)現(xiàn)：高表達Vimentin、Snail and NF-κB與E-cadherin低表達成負相關(P0.001,r=-0.613,P0.001, r=-0.48,P0.001,r=-0.519).Vimentin高表達與Snai核高表達、NF-κB高表達均稱成正相關(P0.001、r=0.428; P=0.002、r=0.291).此外,PEDF高表達與E-cadherin低表達成正相關(P0.001、r=0.496),反而與Vimentin高表達、Snail高表達、NF-κB高表達成負相關(P0.001, r=-0.337; P0.001, r=0.34; P0.001,r=0.383)。4.應用Cox回歸模型單因素分析確認PEDF、Vimentin、E-cadherin、Snail及NF-κB陽性表達(P=0.006、P0.00、P0.00、P=0.001、P0.001),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.015),腫瘤直徑(P=0.012),病理分期(P=0.012)及PR受體情況(P=0.003)為矯正其因素后有統(tǒng)計學意義；年齡、月經(jīng)狀況、組織學分級、ER狀態(tài)均無統(tǒng)計學意義。多因素分析顯示Vimentin與E-cadherin陽性表達是總生存(OS; P=0.016, HR=0.429,95%CI:0.215-0.857及P=0.004, HR＝3.274,95%CI: 1.476-7.262)有統(tǒng)計學意義的預后影響因素,PEDF、腫瘤直徑是無疾病復發(fā)率(DFS)有統(tǒng)計學意義的預后影響因素(DFS;P=0.034, HR=0.723,95%CI:0.361-1.446及P=0.042, HR=1.245,95%CI:1.008-1.537)。第二部分 干擾抑制PEDF蛋白表達對乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及體外侵襲轉(zhuǎn)移的影響研究目的通過對乳腺癌Sk-Br-3細胞系的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定干擾PEDF基因乳腺癌細胞進行檢測,對其增殖、侵襲和凋亡的影響來闡述PEDF基因在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的可能作用；研究方法：1.分別設計siRNA,干擾PEDF在乳腺癌Sk-Br-3細胞中表達(PEDF-siRNA);設計包裝慢病毒質(zhì)粒,在Sk-Br-3細胞包裝和擴增(Lentivirus-PEDF-vector),然后分別將有效干擾序列轉(zhuǎn)染乳腺癌Sk-Br-3細胞,采用免疫熒光染色法檢測PEDF表達下調(diào)／擴增后對細胞骨架形態(tài)的影響；分析轉(zhuǎn)染PEDF-siRNA/Lentivirus-PEDF-vector質(zhì)粒后人乳腺癌Sk-Br-3細胞PEDF蛋白表達的變化；2.通過Transwell小室法侵襲實驗,檢測轉(zhuǎn)PEDF-siRNA/Lentivirus-PEDF-vector質(zhì)粒組、正常對照組和陰性對照組乳腺癌細胞的侵襲能力,分析PEDF-siRNA/Lentivirus-PEDF-vector質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對于人乳腺癌Sk-Br-3細胞增殖能力的影響。3.應用RNA干擾(RNAinterference, RNAi)技術,沉默PEDF基因,觀察乳腺癌細胞體外增殖、侵襲、粘附特性的變化以及應用Western blotting技術檢測人乳腺癌Sk-Br-3細胞的上皮性標記E-cadherin、間質(zhì)性標志Vimentin表達的改變,探討PEDF基因在乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程；4.應用慢病毒包裝包裝輔助質(zhì)粒技術,擴增PEDF基因,轉(zhuǎn)染乳腺癌Sk-Br-3細胞,觀察乳腺癌細胞體外增殖、侵襲、粘附特性的變化以及應用Western blotting技術檢測人乳腺癌Sk-Br-3細胞的上皮性標記E-cadherin、間質(zhì)性標志Vimentin表達的改變,探討PEDF基因在乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程；實驗結(jié)果1.在Sk-Br-3細胞中抑制PEDF的表達和在Sk-Br-3細胞中升高PEDF的表達后進行transwell實驗,結(jié)果表明PEDF可以明顯抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移能力。此外,在Sk-Br-3中過表達PEDF后,免疫熒光染色顯示Sk-Br-3細胞骨架形態(tài)由間質(zhì)樣變?yōu)樯掀印?. Western blotting檢測正常對照組和陰性對照細胞組的PEDF蛋白表達明顯高于轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒細胞組的蛋白表達水平,低于Lentivirus-vector質(zhì)粒細胞組的蛋白表達水平差異具有顯著性(P0.05),其中轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒組蛋白表達水平最低；3. Western blotting檢測在Sk-Br-3中過表達PEDF后結(jié)果顯示Sk-Br-3細胞中上皮細胞標志分子E-cadherin表達顯著上調(diào),而間質(zhì)細胞標志分子Vimentin的表達則顯著下調(diào)；反而轉(zhuǎn)染PEDF-siRNA組結(jié)果顯示Sk-Br-3細胞中上皮標志分子的表達顯著下調(diào),間質(zhì)標志分子的表達顯著上調(diào)。4.統(tǒng)計學分析：采用SPSS13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)統(tǒng)計軟件。使用t檢驗或方差分析細胞遷徙能力和蛋白表達狀況,統(tǒng)計描述以x±s表示。劃痕創(chuàng)面面積不同時間及組間整體比較采用析因設計的方差分析,各單獨效應分析采用單因素方差分析法。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
【關鍵詞】：PEDF E-cadherin Vimentin Snail NF-κB 乳腺癌 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 PEDF EMT 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 乳腺癌 轉(zhuǎn)移
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-18
• 前言18-23
• 參考文獻20-23
• 第一章 PEDF蛋白在乳腺癌中的表達及其與EMT相關性研究23-47
• 1. 材料與方法24-25
• 2. 實驗方法25-27
• 3. 結(jié)果27-40
• 4. 討論40-43
• 5. 參考文獻43-47
• 第二章 干擾抑制PEDF蛋白表達對乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及體外侵襲轉(zhuǎn)移的影響47-67
• 1. 材料與方法47-60
• 2. 結(jié)果60-63
• 3. 討論63-66
• 4. 參考文獻66-67
• 文獻綜述67-83
• 參考文獻76-83
• 附錄83-126
• 中英文縮略詞126-127
• 致謝127-128
• 攻讀學位期間成果128-131
• 統(tǒng)計學審稿證明131

  本文關鍵詞：PEDF基因在乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用與機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：259473