【摘要】：目的:前期通過(guò)關(guān)聯(lián)ARROWSMITH文獻(xiàn)工具分析,發(fā)現(xiàn)心血管系統(tǒng)疾病治療中,黃芪與維生素D之間包含了非常有價(jià)值的隱性規(guī)則。提出黃芪皂苷在心血管疾病治療中可能通過(guò)維生素D系統(tǒng)對(duì)腎素的調(diào)控,進(jìn)而抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活的分子機(jī)制。擬運(yùn)用內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)細(xì)胞肥大模型,結(jié)合siRNA技術(shù),探討黃芪皂苷對(duì)心肌細(xì)胞維生素D系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用,從而調(diào)控腎素的表達(dá)在心肌肥厚治療中的作用機(jī)制,為中醫(yī)藥預(yù)防和治療充血性心力衰竭提供新的治療靶點(diǎn)和新的思路。方法:1.原代心肌細(xì)胞培養(yǎng):取24h-27h內(nèi)的新生SD乳鼠,胰酶消化法,獲得新生大鼠的原代心肌細(xì)胞,并運(yùn)用α-actin免疫組化進(jìn)行心肌細(xì)胞鑒定。2.黃芪皂苷對(duì)內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大模型VDR、CYP27B、CYP24A、腎素表達(dá)的影響:細(xì)胞分組為對(duì)照組,模型組(內(nèi)皮素-1,10-8mol/L),維生素D組(內(nèi)皮素-1,10-8mol/L,維生素D,10-8mmol/L),黃芪皂苷低劑量組(內(nèi)皮素-1,10-8mmol/L,黃芪皂苷,10μg/ml),黃芪皂苷中劑量組(內(nèi)皮素-1,10-8mol/L,黃芪皂苷,20μg/ml),黃芪皂苷高劑量組(內(nèi)皮素-1,10-8mol/L,黃芪皂苷,40μg/ml),分組處理細(xì)胞,干預(yù)24h后,收集細(xì)胞。qRT-PCR 及 westernblot 檢測(cè) VDR、CYP27B、CYP24A、ReninmRNA及蛋白表達(dá)。3.慢病毒VDRsiRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染:按照siRNA設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)VDRsiRNA序列,通過(guò)在細(xì)菌體內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建VDR基因的siRNA慢病毒載體,將LV3-VDRRNAi轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,獲取病毒滴度達(dá)到1×108TU/ml。然后轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,并用RT-PCR檢測(cè)VDR基因沉默的效率。4.黃芪皂苷對(duì)內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的VDRsiRNA心肌細(xì)胞肥大模型CYP27B、CYP24A、腎素表達(dá)的影響:分組:對(duì)照組(Ctrl),VDRsiRNA陰性組(Neg),VDRsiRNA組(Ko),VDRsiRNA+內(nèi)皮素-1 組(內(nèi)皮素-1,10-8mol/L,ET-1),VDRsiRNA+內(nèi)皮素-1+維生素D 組(內(nèi)皮素-1,10-8mol/L,維生素 D,10-8mmol/L,VD),VDRsiRNA+內(nèi)皮素-1+黃芪皂苷低劑量組(內(nèi)皮素-1,10-8mol/L,黃芪皂苷,10μg/ml,Low),VDRsiRNA+內(nèi)皮素-1+黃芪皂苷中劑量組(內(nèi)皮素-1,10-8mol/L,黃芪皂苷,20μg/ml,Mid),VDRsiRNA+內(nèi)皮素-1+黃芪皂苷高劑量組(內(nèi)皮素-1,10-8mol/L,黃芪皂苷,40μg/ml,Hig),分別處理細(xì)胞,干預(yù) 24h 后,收集細(xì)胞。qRT-PCR 及 westernblot 檢測(cè) CYP27B、CYP24A、Renin mRNA及蛋白表達(dá)。5.黃芪皂苷對(duì)內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大模型凋亡的影響:流式細(xì)胞儀檢測(cè)黃芪皂苷對(duì)心肌細(xì)胞VDRsiRNA前后凋亡的影響。6.黃芪皂苷對(duì)內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大模型超微結(jié)構(gòu)的影響:電鏡檢測(cè)黃芪皂苷對(duì)心肌細(xì)胞VDRsiRNA前后超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果:1.原代心肌細(xì)胞培養(yǎng):α-actin染色鑒定心肌細(xì)胞,細(xì)胞胞漿有褐色致密顆粒,為心肌細(xì)胞染色的特征。2.黃芪皂苷對(duì)內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的心肌肥大模型VDR、CYP27B、CYP24A、腎素表達(dá)的影響:1)與對(duì)照組比較,內(nèi)皮素-1(ET-1)模型組VDR、CYP27BmRNA表達(dá)降低(P0.01);模型組CYP24A與Renin,mRNA表達(dá)則升高(P0.05)。與模型組比較,維生素D干預(yù)組VDR、CYP27B mRNA的表達(dá)上調(diào),黃芪皂苷高劑量組VDR與CYP27B mRNA表達(dá)上調(diào)(P0.05)。與模型組比較,維生素D干預(yù)組Renin與CYP24AmRNA的表達(dá)下調(diào)(P0.05),黃芪皂苷高劑量組、中劑量組Renin及CYP24A mRNA的表達(dá)下調(diào)(P0.05)。2)與對(duì)照組比較,內(nèi)皮素(ET-1)模型組的VDR、CYP27B蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05),CYP24A、Renin蛋白表達(dá)升高(P0.05)。與模型組比較,維生素D組、黃芪皂苷高劑量組干預(yù)可以顯著上調(diào)模型組心肌細(xì)胞的VDR與CYP27B蛋白的表達(dá)(p0.05),維生素D組、黃芪皂苷高劑量組、中劑量組干預(yù)顯著下調(diào)CYP24A與RENIN蛋白的表達(dá)(p0.05)。3.慢病毒VDRsiRNA質(zhì)粒的構(gòu)建:通過(guò)在細(xì)菌體內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建VDR基因的siRNA慢病毒載體,將LV3-VDRRNAi轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,滴度達(dá)到1×108TU/ml,然后轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,qRT-PCR證實(shí)能夠有效的抑制VDR的表達(dá),使心肌細(xì)胞VDRmRNA的表達(dá)率下降72%,LV3-VDR RNAi能高效干擾心肌細(xì)胞VDR表達(dá)。RNAi陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染的效率與RNAi相當(dāng),但不影響VDR的表達(dá)。4.黃芪皂苷對(duì)內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的VDRsiRNA心肌肥大模型CYP27B、CYP24A、腎素表達(dá)的影響:1)與對(duì)照組比較,VDRsiRNA心肌細(xì)胞CYP27BmRNA表達(dá)下調(diào)趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);CYP24AmRNA及ReninmRNA表達(dá)上調(diào)(P0.05);2)與VDRsiRNA心肌細(xì)胞組比較,內(nèi)皮素-1(ET-1)誘導(dǎo)VDRsiRNA心肌細(xì)胞組(ET-1組)CYP27BmRNA 表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)(P0.05),CYP24AmRNA、ReninmRNA 表達(dá)上調(diào)(P0.05)。3)與ET-1組比較,維生素D組、黃芪皂苷高劑量組能上調(diào)CYP27B mRNA的表達(dá)(P0.05),下調(diào)ReninmRNA的表達(dá)(P0.05)。4)與對(duì)照組比較,VDRsiRNA心肌細(xì)胞CYP27B蛋白表達(dá)下調(diào),CYP24A蛋白及Renin蛋白表達(dá)上調(diào)(P0.05);5)與VDRsiRNA組比較,內(nèi)皮素(ET-1)組的CYP27B蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05),CYP24A與Renin蛋白的表達(dá)則顯著上調(diào)(P0.05)。維生素D組、黃芪皂苷高劑量組能顯著上調(diào)內(nèi)皮素-1(ET-1)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞VDRsiRNA的CYP27B蛋白的表達(dá),維生素D組下調(diào)Renin、CYP24A蛋白表達(dá)(P0.05);黃芪皂苷對(duì)Renin、CYP24A蛋白表達(dá)具有下調(diào)趨勢(shì)(P0.05)。5.黃芪皂苷對(duì)內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的VDRsiRNA前后心肌細(xì)胞肥大模型凋亡的影響:1)與對(duì)照組比較,內(nèi)皮素1(ET-1)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大模型組,心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加(P0.05)。與模型組比較,維生素D干預(yù)組、黃芪皂苷高、中劑量干預(yù)組心肌細(xì)胞凋亡率降低(P0.05)。與模型組比較,黃芪皂苷低劑量組心肌細(xì)胞凋亡率凋亡率與模型組比較未見(jiàn)差異性(P0.05)。2)與正常組比較,VDRsiRNA組凋亡增加,VDRsiRNA+內(nèi)皮素(ET-1)誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞凋亡率顯著提高(P0.05)。維生素D組、黃芪皂苷高、中劑量組干預(yù)后,可以有效抑制心肌細(xì)胞的凋亡(P0.05)。6.黃芪皂苷對(duì)內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的VDRsiRNA前后心肌細(xì)胞肥大模型超微結(jié)構(gòu)的影響:1)電鏡下可見(jiàn)對(duì)照組心肌細(xì)胞形態(tài)正常細(xì)胞模完整,線粒體等細(xì)胞器數(shù)量正常,胞核清晰完整;ET-1模型組細(xì)胞整體形態(tài)不規(guī)則,線粒體顯著增多且結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞核界限紊亂,染色質(zhì)形態(tài)異常;維生素D組、黃芪皂苷高、中劑量組干預(yù)后,細(xì)胞整體形態(tài)改善,線粒體數(shù)量結(jié)構(gòu)相對(duì)正常,凋亡小體相對(duì)減少,核膜完整,整體細(xì)胞損傷減輕。低劑量組改善不明顯。2)與對(duì)照組比較,對(duì)照組心肌細(xì)胞形態(tài)正常細(xì)胞模完整,線粒體等細(xì)胞器數(shù)量正常,胞核清晰完整;VDRsiRNA組可見(jiàn)線粒體整體數(shù)量減少,結(jié)構(gòu)尚可,核膜尚完整;VDRsiRNA心肌細(xì)胞ET-1模型組細(xì)胞整體不規(guī)則,線粒體增多變大且結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞核界限紊亂,染色質(zhì)較散亂;維生素D組、黃芪皂苷高、中劑量組干預(yù)后心肌細(xì)胞整體形態(tài)改善,線粒體大小結(jié)構(gòu)相對(duì)正常,凋亡小體相對(duì)減少,核膜完整清晰,染色質(zhì)形態(tài)尚規(guī)則。結(jié)論:1.維生素D系統(tǒng)(維生素D受體、CYP27B、CYP24A)參與內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的病理生理過(guò)程中。2.黃芪皂苷具有保護(hù)內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大作用,部分作用是通過(guò)對(duì)心肌細(xì)胞維生素D系統(tǒng)的調(diào)節(jié),而抑制腎素的表達(dá),從源頭阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活。3.黃芪皂苷通過(guò)維生素D系統(tǒng)抑制內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,保護(hù)心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2487120