【摘要】：糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一種以糖代謝紊亂為主、慢性的、全身性的代謝性疾病。β細(xì)胞功能缺陷、胰島素抵抗、遺傳因素和肥胖是Ⅱ型DM的主要致病因素。糖尿病腎臟病變(diabetic nephropathy,DN)是DM主要的微血管并發(fā)癥,易導(dǎo)致終末期腎病的發(fā)生,是引起DM高死亡率的原因之一,受到全世界的普遍關(guān)注。因此,尋找疾病早期診斷標(biāo)記物和治療靶點,對于預(yù)防和治療DN是極其必要的。在我國,中藥治療DM及其并發(fā)癥有著悠久的歷史,愈來愈多的研究表明,中藥可以通過多途徑、多靶點治療DM并發(fā)癥,其中,中藥黃芩和梔子對DN的治療作用日漸受到關(guān)注。本論文采用基于UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)的代謝組學(xué)研究方法,對黃芩和黃芩-梔子藥對治療DN的作用機制開展了系統(tǒng)的研究,主要研究內(nèi)容如下:1.糖尿病腎病及黃芩對其治療作用的代謝組學(xué)研究首先,采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)SD大鼠8周后,利用低劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠DM模型,模型建立10周后出現(xiàn)腎功能損傷癥狀,即發(fā)展為DN。同時,采用藥效學(xué)結(jié)合代謝組學(xué)方法,考察黃芩對模型大鼠的DN防治作用,并與陽性藥的治療作用相比較。結(jié)果顯示,黃芩能夠下調(diào)空腹血糖、降血脂、抗氧化應(yīng)激、緩解DN病程發(fā)展引起的腎臟病理損傷,降低尿蛋白排泄,表明黃芩具有良好的降糖抗腎臟損傷效果。在模型建立后第6周和第10周收集實驗動物尿液,在第10周采集動物血清,進(jìn)行代謝組學(xué)的研究。采用UHPLC-Q-TOF-MS對健康組、模型組、陽性藥治療組和黃芩治療組的尿液及血液樣品進(jìn)行代謝輪廓分析,結(jié)合PCA和OPLS-DA統(tǒng)計分析方法,分析內(nèi)源性代謝物變化,發(fā)現(xiàn)黃芩治療后調(diào)節(jié)了部分與DN模型相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物水平。使用KEGG數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件對這些標(biāo)記物相關(guān)的代謝通路進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),單胺氧化酶(MAO)與DN病程發(fā)展密切相關(guān),MAO在DN大鼠血清中活性顯著升高;黃芩治療后大鼠血清MAO活性受到抑制,說明MAO可能是黃芩治療DN的潛在靶點。此外,我們比較了各組潛在生物標(biāo)記物的相對含量,揭示了黃芩對潛在生物標(biāo)記物表達(dá)水平的影響,從代謝通路的角度闡述DN發(fā)病機制和黃芩治療作用機理。2.黃芩-梔子藥對治療糖尿病腎病作用的代謝組學(xué)研究首先,本研究建立了DM大鼠模型,模型建立12周后出現(xiàn)腎功能損傷癥狀,在此期間,考察黃芩-梔子藥對防治DN的作用,分析黃芩-梔子藥對治療DN的作用途徑。藥效學(xué)結(jié)果表明,黃芩-梔子藥對可有效控制血糖,改善DM引起的血脂變化,抗氧化應(yīng)激,對于DN引起的腎臟病理損傷和腎小球濾過功能下降均有較好的緩解作用,說明黃芩具有良好的降糖抗腎臟損傷效果。在此基礎(chǔ)上,開展了黃芩-梔子藥對治療糖尿病腎病作用的代謝組學(xué)研究。采用UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù),結(jié)合多元統(tǒng)計分析,對各組大鼠尿液和血液樣品進(jìn)行代謝輪廓分析,篩選DN相關(guān)潛在生物標(biāo)記物。比較了各組潛在生物標(biāo)記物的相對含量,并分析黃芩-梔子藥對干預(yù)的代謝通路,結(jié)果表明,黃芩-梔子藥對通過調(diào)節(jié)色氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝、脂質(zhì)代謝和花生四烯酸代謝等通路阻滯DN發(fā)展,從代謝通路角度揭示了黃芩-梔子藥對治療DN的作用機理。3.糖原磷酸化酶抑制劑篩選通過黃芩治療DN大鼠尿液代謝組學(xué)的通路分析,發(fā)現(xiàn)包括MAO和糖原磷酸化酶(Glycogen phophorylase a,GPa)在內(nèi)的多種酶可能是黃芩治療的作用靶點。因此,我們通過體外實驗,進(jìn)一步研究了黃芩提取物、梔子提取物及其主要活性成分對GPa的抑制活性。結(jié)果表明,黃芩素、黃芩苷和漢黃芩苷等黃芩中的黃酮類化合物,具有較好的GPa抑制活性。通過分析這些化合物的抑制活性與結(jié)構(gòu)特征,我們發(fā)現(xiàn),黃酮A環(huán)5,6,7位-OH取代時的GPa抑制活性最佳,而當(dāng)B環(huán)對位引入-OH時,會削弱黃酮化合物的GPa抑制活性。上述結(jié)果為闡明黃芩治療DN的作用機制提供了依據(jù),同時也為防治DN藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。4.肥胖模型動物的尿液代謝組學(xué)研究肥胖不僅是DM致病的主要危險因素之一,還會引起代謝綜合癥和腎臟損傷。值得注意的是,肥胖引起的腎臟損傷與DN的病理生理變化相似,提示兩種疾病可能存在相似的發(fā)病機制。因此,我們利用高脂飲食誘導(dǎo)了大鼠肥胖模型,采用代謝組學(xué)方法,研究了肥胖引起的尿液代謝輪廓變化,并將肥胖和DN疾病相關(guān)潛在生物標(biāo)記物進(jìn)行了對比分析。我們鑒定了20個肥胖相關(guān)的,具有高敏感性和高特異性的潛在生物標(biāo)記物。這些潛在生物標(biāo)記物的變化,涉及了色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和腸內(nèi)菌等代謝通路的代謝紊亂,說明肥胖的發(fā)病機制與這些代謝通路的擾動相關(guān)。同時,我們將肥胖和DN疾病相關(guān)潛在生物標(biāo)記物對比,發(fā)現(xiàn)多種潛在生物標(biāo)記物存在相同的變化趨勢,上述研究結(jié)果從代謝組學(xué)角度揭示了肥胖與DN發(fā)病機制的潛在關(guān)聯(lián),進(jìn)一步證明肥胖是誘發(fā)DN的原因之一。綜上所述,本論文采用UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù),從代謝組學(xué)的角度,揭示了DN的發(fā)病機制,以及黃芩和黃芩-梔子藥對治療DN的作用機理,明確了黃芩和梔子中抑制GPa活性的成分,確證了肥胖與DN發(fā)病機制的潛在關(guān)聯(lián)。為進(jìn)一步闡明黃芩治療DN的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制提供理論依據(jù),同時也為黃芩治療DN新藥開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Diabetes (DM) is a metabolic disorder dominated by sugar metabolism, chronic and systemic. Functional defects, insulin resistance, genetic factors and obesity are the main pathogenic factors of type 鈪，

本文編號：2347918