【摘要】：研究目的乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是一種嗜肝DNA病毒,全球約有4億HBV攜帶者,HBV感染可引起急性、慢性和重型肝炎,并與肝纖維化、肝硬化和肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。HBV被認(rèn)為是一種"隱匿性病毒",在感染早期能夠逃避機(jī)體免疫監(jiān)視,HBV可產(chǎn)生多種病毒相關(guān)蛋白以抑制機(jī)體天然和適應(yīng)性抗病毒免疫應(yīng)答,導(dǎo)致病毒在體內(nèi)長期存在。NLRP3炎癥小體(inflammasome)是一種存在于胞漿中的大分子多蛋白復(fù)合體,能夠感知病原微生物感染、組織損傷和代謝失衡時(shí)所釋放的分子信號,促進(jìn)IL-1β和IL-18等炎性因子的成熟和釋放。NLRP3炎癥小體的活化需要雙信號:第一信號(預(yù)刺激信號)由病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern,PAMP)誘導(dǎo)產(chǎn)生,通過活化NF-κB信號通路而促進(jìn)NLRP3和pro-IL-lp的表達(dá);第二信號(活化信號)由危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMP)誘導(dǎo)產(chǎn)生,通過活化caspase-1促進(jìn)IL-1β等細(xì)胞因子的成熟和分泌。IL-1β作為一種多效炎癥因子,能夠促進(jìn)多種免疫相關(guān)基因的表達(dá),并募集淋巴細(xì)胞至感染部位,抑制包括HBV在內(nèi)的多種病原微生物感染。研究表明,多種病原微生物可通過各種機(jī)制抑制NLRP3炎癥小體的活化,進(jìn)而逃逸機(jī)體的免疫應(yīng)答。但是HBV感染與NLRP3炎癥小體活化之間的關(guān)系尚不清楚。肝臟是人體最重要的代謝和解毒器官,來自腸道中的細(xì)菌成分(如LPS)可通過門靜脈進(jìn)入肝臟,導(dǎo)致肝臟中NLRP3炎癥小體的活化和促炎因子的產(chǎn)生,而肝臟又是HBV的主要感染器官,那么HBV能否通過影響肝內(nèi)NLRP3炎癥小體的活化而促進(jìn)自身的免疫逃逸?為了探討這一問題,在本研究中,我們首先利用HBV體內(nèi)外感染模型證實(shí)HBV自身并不能活化NLRP3炎癥小體;進(jìn)而通過給予LPS誘導(dǎo)肝組織中NLRP3炎癥小體的活化,發(fā)現(xiàn)肝臟Kupffer細(xì)胞是表達(dá)NLRP3炎癥小體和分泌IL-1β的主要細(xì)胞,而HBV感染可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活化;繼而利用體外細(xì)胞模型、HBeAg突變小鼠模型和臨床HBV慢性感染及肝癌患者標(biāo)本證實(shí)HBV分泌的HBeAg介導(dǎo)了對NLRP3炎癥小體活化的抑制作用,并深入探究了其作用機(jī)制;最后,在鼠傷寒感染模型中進(jìn)一步驗(yàn)證了 HBV對NLRP3炎癥小體活化的抑制作用。研究方法1.通過Real-time PCR和Western blotting技術(shù)檢測HBV穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系、HBV感染小鼠及臨床HBV患者肝組織中NLRP3炎癥小體及活化相關(guān)分子的表達(dá)。2.通過尾靜脈高壓注射pAAV/HBV1.2或pAAV/HBV1.2-e-null質(zhì)粒至C57BL/6小鼠體內(nèi),建立HBV感染小鼠模型或HBV-e-null小鼠模型。3.通過ELISA檢測小鼠血清中HBsAg和HBeAg水平;通過免疫組化檢測肝組織原位HBcAg表達(dá);通過熒光定量PCR檢測HBV DNA含量。4.通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測Kupffer細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)。5.通過流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting檢測細(xì)胞中NF-κB的活化。6.利用ZDOCK 3.0.2程序?qū)BeAg與TRAM、MAL分子進(jìn)行模擬對接。7.通過ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清或肝臟研磨液中IL-1β、IL-18和IL-6的水平。8.通過流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測DCF的熒光強(qiáng)度以檢測ROS產(chǎn)生。9.通過Western blotting檢測細(xì)胞膜上p47-phox和Na+/K+ ATPase的表達(dá)。10.通過激光共聚焦顯微鏡分別觀察胞漿中Fluo-3/AM和溶酶體中LysoTracker的熒光強(qiáng)度以檢測細(xì)胞中Ca2+水平和溶酶體穩(wěn)定性。11.用鼠傷寒沙門氏菌分別感染HBV慢性感染小鼠和對照小鼠后,通過檢測肝臟組織中鼠傷寒沙門氏菌的載量和小鼠生存期,以確定小鼠對鼠傷寒沙門氏菌感染的敏感性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.HBV感染不能活化NLRP3炎癥小體HepG2.2.15 細(xì)胞中 NLRP3、pro-caspase-1 和 pro-IL-1β等 NLRP3 炎癥小體相關(guān)分子的表達(dá)水平顯著低于HepG2細(xì)胞;體外用LPS和不同濃度的HBV顆粒刺激分化后的THP-1細(xì)胞不能活化NLRP3炎癥小體;與對照小鼠相比,急性和慢性HBV感染小鼠的肝組織中NLRP3炎癥小體相關(guān)成分及血清中IL-1β表達(dá)均未見明顯升高。2.HBV能夠抑制LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活化HBV慢性感染可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠肝組織中NLRP3和pro-IL-1β的表達(dá)、caspase-1的活化以及IL-1β的成熟;肝臟中的巨噬細(xì)胞是表達(dá)NLRP3炎癥小體和分泌IL-1β的主要細(xì)胞,并且HBV主要抑制小鼠肝臟Kupffer細(xì)胞中IL-1β的表達(dá);用含HBV成分的培養(yǎng)上清孵育分化的THP-1細(xì)胞能夠顯著抑制細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的NLRP3和pro-IL-1β的表達(dá)、caspase-1的活化以及IL-1β的分泌。以上結(jié)果說明,HBV對LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活化有抑制作用。3.HBeAg,而非HBsAg,具有抑制NLRP3炎癥小體活化的作用HBeAg預(yù)孵育可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中的NLRP3和pro-IL-1β的表達(dá)、caspase-1的活化以及IL-1β的成熟;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,HBV慢性感染可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化,但是在HBeAg缺失的HBV慢性感染小鼠中,HBV對炎癥小體的抑制作用減弱;HBeAg不但可以抑制LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活化,還能抑制其它活化劑誘導(dǎo)的該炎癥小體的活化。HBsAg預(yù)孵育與否并不影響LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的活化。以上結(jié)果說明,對NLRP3炎癥小體發(fā)揮抑制作用的是HBeAg,而不是HBsAg。4.HBeAg通過抑制NF-κB的活化抑制NLRP3和pro-IL-11的表達(dá)HBeAg預(yù)孵育分化的THP-1細(xì)胞,可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活化水平和下游細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的表達(dá)。利用ZDOCK 3.0.2程序?qū)BeAg和NF-κB信號通路下游的兩個(gè)接頭分子TRAM和MAL進(jìn)行模擬對接,發(fā)現(xiàn)HBeAg和這兩個(gè)分子均存在結(jié)合區(qū)域。說明HBeAg有可能通過與TRAM和MAL分子結(jié)合而抑制NF-κB的活化。5.HBeAg通過抑制ROS產(chǎn)生抑制NLRP3炎癥小體的活化HBeAg預(yù)孵育分化的THP-1細(xì)胞,可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NADPH氧化酶的活化,進(jìn)而抑制ROS的產(chǎn)生;外加H2O2后,HBeAg對NLRP3炎癥小體的抑制作用明顯降低。6.HBeAg+的臨床HCC和CHB患者體內(nèi)NLRP3炎癥小體的活化被抑制HBeAg+的 HCC 患者癌旁組織 NLRP3、活化的 caspase-1 p20、pro-IL-1β和成熟的IL-1β p17的表達(dá)水平顯著低于HBeAg-患者。同樣,HBeAg+的HCC患者肝組織Kupffer細(xì)胞中IL-1β水平明顯低于HBeAg-患者。免疫耐受期(HBeAg+)CHB患者血清IL-1β水平較低,而部分免疫非活化期(HBeAg-)患者血清IL-1β水平較高。除HBeAg外尚有其它因素對炎癥小體的活化和IL-1β的表達(dá)產(chǎn)生影響。7.HBV慢性感染小鼠對鼠傷寒沙門氏菌感染更加敏感與對照小鼠相比,HBV慢性感染小鼠在感染鼠傷寒沙門氏菌后,體內(nèi)NLRP3和pro-IL-1β的表達(dá)、caspase-1的活化以及IL-1β的分泌更低,肝組織的細(xì)菌載量更高,生存期更短。說明HBV可能通過降低NLRP3炎癥小體的活化和IL-1β的表達(dá)增加小鼠對鼠傷寒沙門氏菌感染的敏感性。結(jié)論及意義1.本研究發(fā)現(xiàn)Kupffer細(xì)胞是肝臟中表達(dá)NLRP3炎癥小體和產(chǎn)生IL-1β的主要細(xì)胞。2.本研究首次發(fā)現(xiàn)HBV本身不能活化NLRP3炎癥小體,但可以通過HBeAg抑制LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活化和IL-1β等促炎因子的產(chǎn)生,從而抑制機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答,有利于HBV在體內(nèi)的存活和慢性感染狀態(tài)的形成。3.本研究首次闡明HBeAg抑制NLRP3炎癥小體的兩個(gè)途徑:既通過抑制NF-κB信號通路抑制NLRP3和pro-IL-1 β分子的表達(dá),又通過抑制ROS抑制caspase-1的活化和IL-1β的成熟。4.本研究首次發(fā)現(xiàn)HBV可通過抑制肝臟NLRP3炎癥小體活化而抑制炎癥反應(yīng)并闡明了其主要分子機(jī)制,揭示了 HBV免疫逃逸的一種新方式,為治療HBV慢性感染及相關(guān)疾病提供新的策略。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R512.62
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本文編號：2332249