本文關(guān)鍵詞：MAPK家族在成骨細(xì)胞分化過程中調(diào)控作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《蘭州大學(xué)》 2015年

MAPK家族在成骨細(xì)胞分化過程中調(diào)控作用的研究

趙良功  

【摘要】：目的：隨著老齡化社會的到來,骨質(zhì)疏松成為世界廣泛關(guān)注的健康問題之一,是絕經(jīng)后女性和老年人的常見病。針對骨質(zhì)疏松合理的治療方案包含藥物治療與運(yùn)動治療相結(jié)合。但由于應(yīng)力在成骨過程中作用機(jī)制不甚明確,臨床醫(yī)生很難指導(dǎo)患者進(jìn)行正確地運(yùn)動治療。同時,現(xiàn)有藥物在治療骨質(zhì)疏松的同時還存在增加乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌等患病率的副作用。探索并發(fā)現(xiàn)促成骨效率高而副作用小或無副作用的骨質(zhì)疏松治療藥物非常重要。本論文通過分別研究MAPK家族成員ERK5在流體剪切力促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及p38 MAPK在紅芪多糖促進(jìn)成骨過程中不同的調(diào)控作用,為臨床正確指導(dǎo)患者進(jìn)行合理運(yùn)動及成骨減少性疾病治療藥物的開發(fā)提供了理論依據(jù)。方法：第一部分：對MC3T3-E1成骨細(xì)胞加載間歇流體剪切力或間歇性流體剪切力,應(yīng)用MEK5/ERK5特異性阻斷劑BIX02189抑制ERK5的活性,研究比較兩種流體剪切力對成骨細(xì)胞分化促進(jìn)作用的強(qiáng)弱以及ERK5在間歇性流體剪切力促進(jìn)成骨細(xì)胞分化過程中的調(diào)控作用；第二部分：水提醇沉淀法從中藥材紅芪中分離得到不同分子量范圍的紅芪多糖(HPS),進(jìn)一步純化得到HPS3d。通過對成骨細(xì)胞給予不同濃度HPS3d刺激72小時,并且應(yīng)用p38 MAPK特異性阻斷劑SB203580抑制p38的活性,通過MTT、RT-PCR和Westernblot等方法研究HPS3d促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和P38 MAPK對上述過程的調(diào)控作用。結(jié)果：第一部分：(1)同對照組相比,持續(xù)性與間歇性流體剪切力均可以促進(jìn)ERK5的磷酸化,增強(qiáng)ALP的活性,促進(jìn)OCN及OPN的蛋白表達(dá)。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),加載間歇性流體剪切力的成骨細(xì)胞中,ERK5磷酸化水平、ALP的活性O(shè)CN、 OPN的蛋白表達(dá)量均明顯高于加載持續(xù)性流體剪切力的成骨細(xì)胞。(2)加載間歇性流體剪切力后,成骨細(xì)胞中ERK5的磷酸化水平較正常組明顯升高,而應(yīng)用10μM的MEK5/ERK5阻斷劑BIX02189孵育2小時后,MEK5/ERK5的活性完全受到抑制。同對照組相比,間歇性流體剪切力可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞中ALP的活性,增加OPN、OCN和Runx-2的表達(dá)。但抑制MEK5/ERK5的活性后,這種促進(jìn)作用也相應(yīng)的受到減弱。同時,單獨應(yīng)用BIX02189對ALP的活性,OPN, OCN和Runx-2的表達(dá)無明顯影響(p0.05)。第二部分：(1)通過對紅芪藥材進(jìn)行提取、分離和純化,從中獲得了組成均一的紅芪多糖HPS3d。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn),HPS3d中多糖含量為94.35%,蛋白質(zhì)含量為3.4%,糖醛酸含量為13.3%,HPS3d為酸性糖蛋白復(fù)合物。元素分析結(jié)果O為53.91%,C為38.18%,H為5.66%,S為1.73%,N為0.52%。HPS3d的分子量范圍為84.6kDa,空間分子構(gòu)象為高枝化度結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)中含有鼠李糖(5.93%)、阿拉伯糖(39.95%)、葡萄糖(6.76%)、半乳糖(39.95%)及半乳糖醛酸(8.05%)。HPS3d的支鏈主要由阿拉伯糖構(gòu)成,而主鏈由半乳糖與半乳糖醛酸構(gòu)成。(2)成骨細(xì)胞分別經(jīng)過濃度為0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml、 8.0mg/ml、16.0mg/ml及32mg/ml的HPS3d刺激72h后,用MTT法檢測細(xì)胞活性。結(jié)果可見,當(dāng)HPS3d濃度為0.5-8.0mg/ml時,細(xì)胞活性同對照組相比無顯著性差異(P0.05)。(3)成骨細(xì)胞分別經(jīng)過濃度為0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml和8.0mg/ml的HPS3d刺激72h后發(fā)現(xiàn),當(dāng)HPS3d濃度為0.5mg/ml時,ALP活性,OPN、OCN和BSP的]mnRNA表達(dá)未受到明顯影響。當(dāng)HPS3d濃度為1.0mg/ml、 2.0mg/ml和4.0mg/ml時,ALP活性,OPN、OCN和BSP的mRNA表達(dá)呈濃度依賴性升高。并且當(dāng)HPS3d濃度為8.0mg/ml時,ALP活性,OPN、OCN和BSP的mRNA表達(dá)同4.0mg/ml組比較不再繼續(xù)升高(P0.05)。(4)用濃度為0.5-8.0mg/ml的HPS3d刺激成骨細(xì)胞胞72h后,Runx-2和Osterix的mRNA表達(dá)量自HPS3d濃度為1.0mg/ml時開始呈劑量依賴性升高,并在4.0mg/ml時達(dá)到最高,同對照組相比,分別升高了5.2倍和6.6倍。進(jìn)一步用濃度為2.0mg/ml和4.0mg/mlHPS3d刺激成骨細(xì)胞72小時后,Western blot檢測Runx-2和Osterix蛋白表達(dá)量均明顯升高。(5)用濃度為0.5-8.0mg/ml的HPS3d刺激成骨細(xì)胞胞72h后,BMP-2的mRNA表達(dá)量自HPS3d濃度為1.0mg/ml時開始呈劑量依賴性升高,并在4.0mg/ml時達(dá)到最高。進(jìn)一步用濃度為2.0mg/mI和4.0mg/mIHPS3d刺激成骨細(xì)胞72小時后,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)SMAD1/5/8的磷酸化水平較對照組升高。(6)用p38特異性阻斷劑SB203580預(yù)處理成骨細(xì)胞后再經(jīng)過4.0mg/ml HPS3d刺激72小時后,同對照組相比,經(jīng)HPS3d單獨刺激的成骨細(xì)胞中p38MAPK的磷酸化水平升高。p38 MAPK的特異性阻斷劑可以抑制上述HPS3d介導(dǎo)的p38 MAPK磷酸化。而HPS3d促進(jìn)的ALP活性增強(qiáng)、OCN、OPN、BSP、 Runx-2和Osterix的mRNA表達(dá)升高在用SB203580后均受到不同程度的抑制。結(jié)論1、強(qiáng)度為12dyn/cm2的持續(xù)性與間歇性流體剪切力均可以促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞ERK5的磷酸化,增強(qiáng)ALP的活性,促進(jìn)OCN及OPN的蛋白表達(dá)。進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。同持續(xù)性流體剪切相比,間歇性流體剪切力是一種更為有效的成骨細(xì)胞分化促進(jìn)應(yīng)力形式。2、抑制MEK5/ERK5的活性后,間歇性流體剪切力促進(jìn)的成骨細(xì)胞中ALP的活性與OPN、OCN表達(dá)增加均受到抑制。MEK5/ERK5對流體剪切力促進(jìn)成骨細(xì)胞分化具有調(diào)控作用。而成骨細(xì)胞分化關(guān)鍵性調(diào)控因子Runx-2的表達(dá)同時降低,說明除了ERKl/2與p38外,Runx-2的表達(dá)還受到MEK5/ERK5的調(diào)控。3、最終獲得的紅芪多糖的主要部分HPS3d為白色絮狀物,極易溶于水,為酸性糖蛋白復(fù)合物。元素含量O為53.91%,C為38.18%,H為5.66%,S為1.73%,N為0.52%。分子量范圍為84.6kDa,分子結(jié)構(gòu)為高枝化度；支鏈主要由阿拉伯糖構(gòu)成,而主鏈由半乳糖與半乳糖醛酸構(gòu)成。4、適當(dāng)濃度的HPS3d可以促進(jìn)ALP活性,使OPN、OCN和BSP的mRNA表達(dá)并且呈濃度依賴性升高,進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化；同時HPS3d使BMP-2、SMAD1/5/8、Runx-2和Osterix蛋白和mRNA的表達(dá)均升高。說明在HPS3d促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的過程中BMP-2/SMAD/Runx-2/Osterix信號通路被激活。同時中低濃度HPS3d對細(xì)胞無明顯毒性作用。5、HPS3d還可以激活p38 MAPK,在p38的活性受到特異性阻斷劑的抑制后,成骨細(xì)胞分化相關(guān)的多種蛋白表達(dá)及Runx-2和Osteri的表達(dá)均明顯受到抑制,說明p38 MAPK通過Runx-2/Osterix發(fā)揮調(diào)控HPS3d促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285
【目錄】：

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5 李文鋒;炎癥對骨折愈合過程中成骨細(xì)胞分化的影響及分子機(jī)制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

6 張偉;牛源乳鐵蛋白促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

7 張燕;DDR2在成骨細(xì)胞分化過程中的作用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

8 張璇;柚皮甙誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的實驗研究[D];中南大學(xué);2006年

9 趙紅斌;應(yīng)變對間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的力學(xué)響應(yīng)機(jī)制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

10 李輝;一個新的調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的microRNA的克隆及其功能研究[D];中南大學(xué);2010年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 謝躍強(qiáng);MiR-146a-5p促進(jìn)APTG-CM誘導(dǎo)的PDLSCs向成骨細(xì)胞分化的功能研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 王寶剛;沖擊波誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的研究[D];吉林大學(xué);2007年

3 姜晴;組蛋白去乙酰化酶4在成骨細(xì)胞分化中作用的初步探究[D];東北師范大學(xué);2011年

4 李巍;堿性成纖維細(xì)胞生長因子對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化影響的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

5 王金鳳;內(nèi)源性FGF23對PTH促成骨細(xì)胞分化作用的影響[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

6 李玉姍;Sirt2對成骨細(xì)胞分化的影響[D];東北師范大學(xué);2012年

7 簡靜;毛蕊異黃酮葡糖苷通過BMP/Wnt信號通路促進(jìn)ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[D];湖北大學(xué);2014年

8 林煜;健骨顆粒對成骨細(xì)胞分化影響的實驗研究[D];福建中醫(yī)學(xué)院;2009年

9 陳允嘉;放線共生放線桿菌培養(yǎng)上清對成骨細(xì)胞分化及間隙連接通訊的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

10 秦斐;亞硒酸鈉抑制黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的機(jī)理研究[D];華中科技大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：MAPK家族在成骨細(xì)胞分化過程中調(diào)控作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：230325