本文關(guān)鍵詞：致癌染料的生理毒性及分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《貴陽醫(yī)學院》 2015年

通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯斑馬魚hoxb4基因及其突變體基因型的初篩

袁夢  

【摘要】：目的:造血干細胞是一群具有高度的自我復制及多項分化潛能的最原始的造血細胞。人類HOXB4基因編碼一類具有同源盒DNA依賴的結(jié)構(gòu)域核蛋白,在造血干細胞的自我更新和分化過程中起到重要的調(diào)控作用。如何在體外擴增造血干細胞,使其既能保留其自我更新的特征又可以向不同血細胞分化是目前研究的重點和難點,調(diào)控其增殖和分化的因素和機制尚不明了,本課題采用高效基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cas9在基因組水平對斑馬魚的hoxb4基因進行編輯,并對其進行陽性突變體的篩選,以期建立下調(diào)hoxb4基因的突變體斑馬魚模型,為進一步篩選其下游靶基因及探討對造血系統(tǒng)的作用機制提供實驗材料及理論依據(jù)。方法:根據(jù)hoxb4基因的一號外顯子的正義鏈及反義鏈設計3個長約20bp的g RNA,分別靶向Exon I的192#位點,244#位點及313#位點�；瘜W合成g RNA(guide RNA)寡核苷酸序列,經(jīng)過酶切克隆連入p T7-g RNA質(zhì)粒中,構(gòu)建g RNA的體外轉(zhuǎn)錄載體并通過體外轉(zhuǎn)錄得到靶位點的g RNA。將質(zhì)粒p SP6-2s NLS-sp Cas9線性化后經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄得到Cas9的m RNA并進行添加A尾修飾,將以上靶位點的g RNA與Cas9的m RNA共注射入單細胞期的斑馬魚胚胎內(nèi),提取靶序列基因組DNA,PCR擴增出靶序列并使用T7EI酶切測效,最后將PCR產(chǎn)物連入p MD19-T simple載體中,挑取陽性克隆進行菌落PCR鑒定,然后經(jīng)Sanger測序檢測突變類型。結(jié)果:1.hoxb4靶序列基因組DNA的核酸擴增產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定結(jié)果與預期相符;2.設計的敲除hoxb4靶點的g RNA寡核苷酸雙鏈成功連入p T7-g RNA質(zhì)粒中且經(jīng)堿基序列鑒定與預期相符;3.靶向hoxb4基因一號外顯子的313#位點的g RNA成功編輯斑馬魚hoxb4基因,經(jīng)T7EI酶切檢測其敲除效率高達26.5%;4.313#靶序列的核酸擴增產(chǎn)物成功連入p MD19-T simple載體中并經(jīng)測序篩選得到4種陽性突變型;5.有30%的斑馬魚可看到心包增大、心腔壁變薄及血流減緩血細胞減少的表現(xiàn)。結(jié)論:1.作為同源盒基因的hoxb4基因其表達可能在一定程度上呈現(xiàn)功能冗余性,即一個基因的異�？梢员涣硪粋�基因的功能來補償而不致引發(fā)疾病;2.通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功編輯斑馬魚hoxb4基因并測序鑒定其突變類型,為HOXb4基因功能的研究提供可靠的基因敲除方法,為尋找其下游靶基因提供實驗材料,為后期探討其機制并進一步行體外擴增造血干細胞提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：貴陽醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R457.7
【目錄】：

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