發(fā)布時間：2018-06-28 15:49

  本文選題：巨噬細胞 + TLR2受體�。� 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：第一部分TLR2/NADPH氧化酶通路在COM晶體-巨噬細胞反應(yīng)中的作用目的:觀察COM晶體-巨噬細胞反應(yīng)中TLRs受體的表達情況,初步探討TLRs-NADPH通路在COM晶體-巨噬細胞反應(yīng)中的作用。方法:根據(jù)前期實驗,選用500ug/ml COM晶體刺激巨噬細胞,利用Real-time PCR法檢測細胞TLR2m RNA、TLR4m RNA、p47phoxm RNA與p91phoxm RNA基因相對表達量;利用流式細胞儀檢測細胞膜蛋白TLR2表面受體的表達;利用Wester-blot法檢測p47phox與p91phox蛋白表達情況;利用熒光酶標儀觀察細胞內(nèi)ROS表達情況。在巨噬細胞與COM晶體培養(yǎng)體系中給予NADPH氧化酶阻斷劑Apocynin后,觀察細胞內(nèi)ROS表達情況。給予TLR2受體抑制劑后,利用Wester-blot法檢測細胞p47phox蛋白的表達情況。結(jié)果:COM晶體刺激巨噬細胞后,TLR2m RNA表達明顯升高(*P0.01);TLR4m RNA表達未見明顯變化(P0.05);TLR2蛋白表達明顯升高(*P0.01);細胞內(nèi)ROS明顯升高(*P0.01)。給予NADPH氧化酶阻斷劑Apocynin干預(yù)后,細胞內(nèi)ROS明顯降低(*P0.01)。給予TLR2受體抑制劑(FSL-1)后,p47phox蛋白的表達明顯降低(P0.05)。結(jié)論:巨噬細胞可能通過TLR2受體識別COM晶體或晶體結(jié)合的基質(zhì),進而激活NADPH氧化酶產(chǎn)生大量ROS。TLR2/NADPH氧化酶通路在草酸鈣結(jié)石形成中可能發(fā)揮了重要作用。第二部分COM晶體通過NADPH氧化酶依賴性ROS生成誘導(dǎo)巨噬細胞NLRP3炎癥小體活化的研究目的:觀察COM晶體-巨噬細胞反應(yīng)中NLRP3炎癥小體表達情況,探討NLRP3炎癥小體的活化機制。評估阿托伐他汀對COM晶體-巨噬細胞反應(yīng)中NLRP3炎癥小體活化的影響。方法:在巨噬細胞與COM晶體共培養(yǎng)體系中,利用Real-time PCR法檢測細胞NLRP3m RNA和Caspase-1m RNA基因相對表達量。利用Wester-blot法檢測細胞NLRP3和Caspase-1蛋白的表達。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定細胞上清液中IL-1β、IL-18的蛋白表達情況。分別用NADPH氧化酶抑制劑(Apocynin)、TLR2受體抑制劑(FSL-1)及藥物阿托伐他汀預(yù)處理巨噬細胞后,利用Wester-blot法檢測細胞NLRP3和Caspase-1蛋白的表達。結(jié)果:NLRP3和Caspase-1蛋白水平與m RNA表達量在COM晶體刺激巨噬細胞后均明顯升高(*P0.01);細胞上清液中IL-1β、IL-18表達明顯升高(*P0.05)。給予NADPH氧化酶抑制劑、TLR2受體阻滯劑或阿托伐他汀干預(yù)后,NLRP3及Caspase-1的活性蛋白P20的表達明顯降低(*P0.05)。結(jié)論:COM晶體刺激巨噬細胞NLRP3炎癥小體激活。COM晶體通過NADPH氧化酶依賴性ROS生成誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體活化。阿托伐他汀能夠抑制COM晶體誘導(dǎo)巨噬細胞NLRP3炎癥小體的激活。第三部分COM晶體刺激巨噬細胞NLRP3-HMGB1炎癥信號通路作用的研究目的:觀察細胞培養(yǎng)液中HMGB1的表達情況,探討NLRP3-HMGB1炎癥信號通路在晶體-巨噬細胞炎癥反應(yīng)過程中的作用。方法:利用Real-time PCR法檢測細胞HMGB1m RNA基因的相對表達量。利用Wester-blot法檢測細胞培養(yǎng)液上清中HMGB1蛋白的表達情況。使用RNA干擾技術(shù),將NLRP3-Si RNA轉(zhuǎn)染巨噬細胞后,利用Wester-blot法檢測細胞培養(yǎng)液上清中HMGB1蛋白的表達。結(jié)果:COM晶體刺激巨噬細胞后,細胞培養(yǎng)液中HMGB1的表達明顯升高(*P0.05)。NLRP3-Si RNA轉(zhuǎn)染巨噬細胞后,HMGB1的表達明顯降低(*P0.01)。結(jié)論:COM晶體刺激巨噬細胞HMGB1的釋放,NLRP3-HMGB1炎癥信號通路在COM晶體-巨噬細胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。
[Abstract]:Part 1: the role of TLR2/NADPH oxidase pathway in the COM crystal macrophage reaction: To observe the expression of TLRs receptor in the COM crystal macrophage reaction, and to explore the role of TLRs-NADPH pathway in the COM crystal macrophage reaction. Method: according to the earlier experiment, 500ug/ml COM crystal was selected to stimulate macrophage, and Re was used in Re. Al-time PCR method was used to detect the relative expression of TLR2m RNA, TLR4m RNA, p47phoxm RNA and p91phoxm RNA gene, and the expression of cell membrane protein TLR2 surface receptor was detected by flow cytometry, and the expression of the protein was detected by Wester-blot method. After giving the NADPH oxidase blocking agent Apocynin in the crystal culture system, the expression of ROS in the cell was observed. After the TLR2 receptor inhibitor was given, the expression of p47phox protein was detected by Wester-blot. The results showed that the RNA expression of TLR2m increased significantly (*P0.01) after the COM crystal stimulated the macrophage (*P0.01), and the expression of TLR4m RNA was not obviously changed. The expression of LR2 protein increased significantly (*P0.01), and the intracellular ROS increased significantly (*P0.01). ROS in cells decreased significantly (*P0.01) after the NADPH oxidase blocker Apocynin. The expression of p47phox protein was significantly reduced after the TLR2 receptor inhibitor (FSL-1). Conclusion: macrophages may identify crystals or crystal binding by the receptor. The matrix, and then activation of NADPH oxidase to produce a large number of ROS.TLR2/NADPH oxidase pathway may play an important role in the formation of calcium oxalate stones. The second part of COM crystal can induce the activation of macrophage NLRP3 inflammatory corpuscle through NADPH oxidase dependent ROS: observe the NLRP3 inflammation in the COM crystal macrophage reaction The effect of atorvastatin on the activation of NLRP3 inflammatory corpuscles in COM crystal macrophage reaction was evaluated by the expression of NLRP3. Methods: in the co culture system of macrophages and COM crystals, the relative expression of NLRP3m RNA and Caspase-1m RNA genes was detected by Real-time PCR method. Wester-blot method was used to detect the relative expression of NLRP3m RNA and Caspase-1m RNA genes. The expression of NLRP3 and Caspase-1 protein in cells was detected. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the protein expression of IL-1 beta and IL-18 in the supernatant. NADPH oxidase inhibitor (Apocynin), TLR2 receptor inhibitor (FSL-1) and drug atorvastatin were used to pretreat macrophage cells, and NLRP3 and Caspase-1 were detected by Wester-blot. Results: the level of NLRP3 and Caspase-1 protein and the expression of M RNA increased significantly after the COM crystal stimulated macrophages (*P0.01), and the expression of IL-1 beta and IL-18 in the cell supernatant was significantly increased (*P0.05). The prognosis of NADPH oxidase inhibitor, TLR2 receptor blocker or Atorvastatin The expression was significantly reduced (*P0.05). Conclusion: COM crystal stimulated macrophage NLRP3 inflammatory body to activate.COM crystal through NADPH oxidase dependent ROS generation to induce the activation of NLRP3 inflammatory corpuscle in macrophage. Atorvastatin could inhibit the activation of NLRP3 inflammatory corpuscle in macrophage induced by COM crystal. Third part COM stimulates NL macrophage NL. Study on the role of RP3-HMGB1 inflammatory signaling pathway: To observe the expression of HMGB1 in cell culture fluid and to explore the role of NLRP3-HMGB1 inflammatory signaling pathway in the process of inflammatory reaction of crystal macrophage. Methods: the relative expression of HMGB1m RNA gene was detected by Real-time PCR method. Cell culture fluid was detected by Wester-blot method. The expression of HMGB1 protein in the supernatant. After transfecting NLRP3-Si RNA into macrophages using RNA interference technique, the expression of HMGB1 protein in the supernatant of cell culture liquid was detected by Wester-blot. Results: after the stimulation of the macrophage by COM crystal, the expression of HMGB1 in the cell culture fluid increased significantly (*P0.05).NLRP3-Si RNA transfection of macrophage, HMGB1. The expression was significantly reduced (*P0.01). Conclusion: the COM crystal stimulates the release of HMGB1 in macrophages, and the NLRP3-HMGB1 signaling pathway plays an important role in the inflammatory response of COM crystal macrophage.
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R692.4

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本文編號：2078523