本文選題：甲型H1N1流感病毒 + 反向遺傳學(xué)��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：近年來,頻繁爆發(fā)的甲型流感不僅給人類的生命健康帶來了嚴重威脅,而且給經(jīng)濟造成了巨大損失,甚至影響到了社會穩(wěn)定。通過氣溶膠傳播、擴大感染范圍是其能引起全球大流行的一個重要因素。2009年爆發(fā)的甲型H1N1流感就是因病毒能經(jīng)氣溶膠傳播,具有強大的人傳人能力,而被世界衛(wèi)生組織(WHO)將警戒級別提至最高級—6級。該事件進一步引發(fā)了人們對流感病毒氣溶膠傳播機理研究的關(guān)注。但是目前對于流感病毒的氣溶膠傳播機制還不是十分清楚。影響流感病毒氣溶膠傳播效率的因素有很多,如環(huán)境因素、流感病毒自身的關(guān)鍵位點氨基酸序列、宿主呼吸道唾液酸相關(guān)的受體類型、體內(nèi)的抗病毒藥物或疫苗免疫水平、在呼吸道的沉積效率等。與研究病毒氣溶膠擴散動力學(xué)同等重要的是,監(jiān)測具有氣溶膠傳播特性的流感病毒在感染宿主過程中呼吸道內(nèi)載量的動態(tài)變化,能為流感病毒的組織嗜性、復(fù)制與清除規(guī)律、致病與傳播分子機制的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐,對于進一步研究流感病毒的氣溶膠傳播機制具有重大意義。目前,傳統(tǒng)的病毒體內(nèi)沉積研究方法需要大量使用動物,在不同的時間點剖檢,不僅費時、費力,而且存在較大的生物安全隱患。而活病毒標記及可視化研究能夠有效克服上述不足,可以實時、便捷地反映病毒感染過程。本課題利用反向遺傳操作技術(shù),在甲型H1N1流感病毒A/PuertoRico/8/34(PR8)的NA末端插入外源熒光素酶基因Gluc(Gaussia luciferase),構(gòu)建可視化的重組熒光素酶甲型H1N1流感病毒(IAV-Gluc),為開展流感病毒動物感染研究提供了一種實時、動態(tài)、可視化監(jiān)測呼吸道病毒載量變化的方法。該方法通過檢測活體動物呼吸道生物發(fā)光情況,快速確定病毒的組織分布及載量情況,實現(xiàn)對動物體內(nèi)病毒載量連續(xù)、實時的動態(tài)監(jiān)測,具有操作簡便、結(jié)果直觀、可快速定性定量等特點。本研究共分四部分:一是完成了IAV-Gluc的構(gòu)建與鑒定。以A/Puerto Rico/8/34(PR8)毒株為骨架,利用反向遺傳學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建8個雙向轉(zhuǎn)錄/表達質(zhì)粒,將8個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞(人胚胎腎細胞),轉(zhuǎn)染上清接種9日齡的SPF雞胚,進行重組病毒IAV-Gluc拯救。通過凝集試驗(HA)、基因擴增、形態(tài)學(xué)觀察、熒光素酶基因表達水平的驗證和鑒定,均證實了重組熒光素酶甲型H1N1流感病毒(IAV-Gluc)構(gòu)建成功,且該病毒能夠穩(wěn)定表達Gluc。二是完成了IAV-Gluc生物學(xué)特性研究。本研究從穩(wěn)定性、致病性、傳播能力、增殖能力、NA活性及受體結(jié)合特性六個方面對拯救毒株IAV-Gluc的生物學(xué)特性進行了分析比較。結(jié)果表明,IAV-Gluc能夠在P1-P5代穩(wěn)定表達熒光素酶基因,且在5代間表達無顯著差異;致病力約為野生毒PR8的1/1000;在豚鼠間獲得了100%的直接接觸傳播與氣溶膠傳播能力,與野生毒株一致;在SPF雞胚上增殖能力約為野生毒的1/20,增殖曲線無明顯差異;與野生毒的神經(jīng)氨酸酶相對活性不存在顯著性差異,表明對病毒的釋放能力無影響;二者均表現(xiàn)出完全的α2,3唾液酸受體結(jié)合能力。上述結(jié)果表明獲得的IAV-Gluc除致病力減弱外,極大地保留了野生毒株的生物學(xué)特性。三是完成了IAV-Gluc在呼吸道內(nèi)沉積的可視化監(jiān)測研究。本研究結(jié)合體外成像技術(shù),分析了病毒在小鼠體內(nèi)復(fù)制、清除的動態(tài)過程。以IAV-Gluc滴鼻感染BALB/c小鼠(5×103EID50/只)后,利用IVIS SPECTRUM體外成像系統(tǒng)對其體內(nèi)的病毒載量進行連續(xù)6天的可視化監(jiān)測,24h即能在體外檢測到生物發(fā)光信號,48h后達到峰值。生物發(fā)光來源為小鼠肺部和氣管,且肺部的生物熒光強度與病毒滴度有極強的正相關(guān)線性關(guān)系(R2=0.9866);同時,建立了生物發(fā)光快速鑒定病毒感染的方法,相比于傳統(tǒng)的qRT-PCR技術(shù)來說,不僅可以直接評價動物體內(nèi)活病毒載量,而且在保證準確性前提下,大大縮短了樣品處理步驟和實驗所需時間。四是完成了不同感染方式下IAV-Gluc在呼吸道內(nèi)沉積與復(fù)制的比較研究。當保證滴鼻與氣溶膠暴露兩種方式下攻毒的劑量相同(2.43×105 EID50)時,滴鼻時有12.27%的病毒到達豚鼠肺部且呈點狀分布,氣溶膠暴露時有1.34%的病毒到達豚鼠肺部且呈均勻分布,后者導(dǎo)致病毒在48h內(nèi)更加有效的復(fù)制;從復(fù)制效率來看,氣溶膠暴露感染組的豚鼠肺部病毒載量持續(xù)增高48h后才開始下降,最高載量為原始沉積量的11073倍,而滴鼻感染組的豚鼠肺部病毒載量在24h開始下降,且最高載量僅為原始沉積量的15.4倍。說明氣溶膠暴露方式感染更有利于病毒在肺部的復(fù)制,比滴鼻方式具有更高的感染效能。本研究成功構(gòu)建了攜帶Gaussia Luciferase基因的可視化重組熒光素酶甲型H1N1流感病毒(IAV-Gluc);從穩(wěn)定性、致病性、傳播能力、增殖能力、NA活性及受體結(jié)合特性等方面鑒定,結(jié)果顯示該重組病毒極大地保留了野生毒株的生物學(xué)特性;滴鼻感染小鼠后在肺部和氣管內(nèi)可檢測到生物發(fā)光信號,并且生物發(fā)光強度與病毒滴度呈正相關(guān);該病毒適用于對感染動物的快速鑒定研究,在前處理和檢測時間上優(yōu)于傳統(tǒng)的qRT-PCR技術(shù),而且能夠直接評價體內(nèi)的活病毒載量;同時,利用可視化病毒進行氣溶膠暴露研究首次發(fā)現(xiàn),甲型H1N1流感病毒氣溶膠暴露比滴鼻感染在豚鼠肺部增殖持續(xù)時間更長,載量更高,分布更均勻,具有更高的感染效能。本研究為進一步評價甲型流感病毒的體內(nèi)沉積與體外傳播規(guī)律研究、闡明其致病分子機制和抗病毒藥物的篩選及候選疫苗株的研發(fā)提供基礎(chǔ),同時為開展其他亞型流感病毒研究提供技術(shù)參考。
[Abstract]:In recent years, frequent outbreak of influenza A influenza not only poses a serious threat to human life and health, but also causes great losses to the economy, and even affects social stability. The spread of the infection by aerosol is an important factor in the global pandemic that causes the global pandemic in.2009. The influenza A (H1N1) influenza is caused by the virus. The aerosol transmission, which has powerful human ability, has been raised to the highest level - 6 by the WHO (WHO). This event has further aroused people's attention to the research on the transmission mechanism of influenza virus aerosol. However, the current mechanism of influenza virus transmission is not yet very clear. There are many factors such as the environmental factors, the amino acid sequence of the key loci of the influenza virus itself, the type of receptor related to the saliva acid in the host respiratory tract, the antiviral drugs in the body or the immunization level of the vaccine in the body, the efficiency of the deposition of the respiratory tract, etc.. The dynamic changes in the respiratory load in the respiratory tract of the influenza virus infected by the sol-transmission characteristics can provide basic data and technical support for the tissue eosinophilia of the influenza virus, the law of replication and scavenging, the research of pathogenic and spreading molecular mechanism, and is of great significance to the further study of the mechanism of aerosol transmission of influenza virus. The traditional methods for the study of the virus in vivo need to use a large number of animals. It is not only time-consuming and laborious, but also has a great potential for biological safety at different time points. However, the study of living virus markers and visualization can effectively overcome the above deficiencies and can reflect the process of virus infection in real time and conveniently. As a technique, the exogenous luciferase gene Gluc (Gaussia luciferase) was inserted at the NA terminal of H1N1 influenza A (PR8) virus A/PuertoRico/8/34 (PR8) to construct a visual recombinant luciferase a H1N1 influenza virus (IAV-Gluc). It provides a real-time, dynamic and visual monitoring of the viral load variation of the respiratory virus in the study of influenza virus infection. By detecting the bioluminescence of the respiratory tract of living animals, this method can quickly determine the distribution and load of the virus, and realize the continuous and real-time dynamic monitoring of the viral load in the animal body. It has the characteristics of simple operation, direct result and rapid qualitative and quantitative. The study is divided into four parts: first, the IAV-Gluc is completed. Construction and identification. Using the A/Puerto Rico/8/34 (PR8) strain as the skeleton, 8 bi-directional transcriptional / expression plasmids were successfully constructed by reverse genetics technology. The 8 plasmids were co transfected to 293T cells (human embryonic kidney cells) and transfected into the supernatant to inoculate the SPF chicken embryos of 9 days old. The recombinant virus IAV-Gluc rescue was carried out. By HA, gene amplification and morphological view Verification and identification of luciferase gene expression level confirmed the success of recombinant luciferase a H1N1 influenza virus (IAV-Gluc), and the virus was able to stabilize the expression of Gluc. two to complete the study of the biological characteristics of IAV-Gluc. This study was from stability, pathogenicity, transmission, proliferation, NA activity and receptor binding properties of six. The biological characteristics of the rescue strain IAV-Gluc were analyzed and compared. The results showed that IAV-Gluc could express the luciferase gene steadily in the P1-P5 generation, and there was no significant difference in the expression between the 5 generations; the pathogenicity was about 1/1000 of the wild venom PR8, and 100% of the direct contact transmission and aerosol transmission ability between the guinea pigs and the wild strains were obtained. There was no significant difference in proliferation curve between the SPF chicken embryo and the wild poison 1/20; the relative activity of the wild poisonous neuraminidase had no significant difference, indicating that there was no effect on the release ability of the virus; all two showed the complete alpha 2,3 sialic acid receptor binding ability. The results showed that the obtained IAV-Gluc was the pathogenicity of the virus. The biological characteristics of the wild strains were greatly preserved. Three the visual monitoring of the IAV-Gluc in the respiratory tract was completed. This study combined with in vitro imaging techniques to analyze the dynamic process of replication and clearance of the virus in mice. The IVIS SPECTRUM body was used after the infection of the BALB/ c mice (5 x 103EID50/). The external imaging system visualized the viral load in the body for 6 days. 24h could detect the bioluminescence signal in vitro and peak after 48h. The bioluminescence was derived from the lung and trachea of mice, and the biological fluorescence intensity of the lung was closely related to the virus titer (R2=0.9866); at the same time, the bioluminescence was established. The method of rapid identification of virus infection by luminescence, compared with the traditional qRT-PCR technology, not only can directly evaluate the live virus load in the animal body, but also greatly shorten the sample processing steps and the time required for the experiment under the premise of ensuring the accuracy. Four, the ratio of the deposition and replication of IAV-Gluc in the respiratory tract under different infection modes has been completed. When the dosage of the nose drops and the aerosol exposure were equal (2.43 x 105 EID50), when the nose drops, 12.27% of the virus arrived in the lungs of the guinea pig and showed a spot distribution. When the aerosol was exposed, 1.34% of the virus reached the guinea pig lung and distributed evenly. The latter was more effective in replicating the virus in the 48h; from replication effect. In the aerosol exposure group, the lung virus load of the guinea pigs exposed to the infection group continued to increase after 48h, and the maximum load was 11073 times that of the original deposit, while the virus load of the guinea pig lungs began to decrease at 24h, and the maximum load was only 15.4 times that of the original deposition. Replication of the lungs is more effective than nasal drip. This study successfully constructed a visualized recombinant luciferase a H1N1 influenza virus (IAV-Gluc) carrying the Gaussia Luciferase gene, and identified the recombinant disease from stability, pathogenicity, transmission ability, proliferation, NA activity and receptor binding properties. The biological characteristics of the wild virus are greatly preserved, and the bioluminescence signal can be detected in the lungs and trachea after the nose drops infected mice, and the bioluminescence intensity is positively correlated with the virus titer; the virus is suitable for the rapid identification of infected animals and is superior to the traditional qRT-PCR technology in the preprocessing and detection time. It can be used to evaluate the live virus load in the body directly. At the same time, the study of aerosol exposure by visual virus is the first time to find that the exposure of H1N1 influenza A virus is longer, more load, more uniform and more effective than the infection of nasal drops in the lungs of Guinea pigs. This study is to further evaluate influenza A (a) influenza. The study of the body deposition and in vitro propagation of the virus, clarifies the screening of its pathogenic molecular mechanism and antiviral drugs, and provides the basis for the research and development of candidate vaccine strains, and provides a technical reference for the development of other subtype influenza viruses.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R373

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本文編號：2072781