本文選題：皮膚再生 + Y27632��； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：口腔頜面部腫瘤除了發(fā)生于舌、唇、頰、唾液腺等部位外,面部皮膚腫瘤也不容忽視,而皮膚腫瘤切除或者皮膚外傷可造成皮膚缺損。皮膚損傷后創(chuàng)口通過來自傷口邊緣的表皮化或瘢痕收縮而恢復(fù),影響患者外貌或者解剖結(jié)構(gòu)的缺陷[1]。目前治療皮膚損傷最普通的方法是移植其他部位的完整皮膚至損傷處,對于較大面積的損傷此方法具有明顯的局限性。因?yàn)槠つw的結(jié)構(gòu)和功能相對簡單,研究者通過結(jié)合支架材料、種子細(xì)胞和生物分子等產(chǎn)生表皮或真皮類似物、雙層活皮膚替代物,應(yīng)用于臨床以修復(fù)由于創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)等造成的皮膚缺損[2-4],但是這些皮膚類似物在臨床應(yīng)用方面長期效果也不佳,因?yàn)樗鼈內(nèi)狈φ嫫そM織、皮下組織及皮膚附屬器。再生醫(yī)學(xué)一直是醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)話題,其目的是通過再生形成功能性的活體組織來修復(fù)或代替因疾病、創(chuàng)傷、老化等原因損傷的或先天性缺陷的人體器官。皮膚是人體最大的器官,而且皮膚結(jié)構(gòu)和功能相對簡單,在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛研究。我們課題組致力于再生出具有皮膚附屬器,如毛囊、汗腺及皮脂腺的人類皮膚,此技術(shù)不僅為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中其他組織的研究奠定基礎(chǔ),對于臨床應(yīng)用也具有重要意義。基于我們課題組的前期研究,本課題致力于進(jìn)一步提高裸鼠體內(nèi)再生帶有成熟毛發(fā)的人類皮膚的成功率。為達(dá)到此目的,我們優(yōu)化了體外人皮膚表皮細(xì)胞原代分離培養(yǎng)方法,改善了移植前體外細(xì)胞培養(yǎng)方法,并且我們已將此皮膚模型成功運(yùn)用到研究皮膚創(chuàng)傷愈合的實(shí)驗(yàn)研究中。第一部分優(yōu)化體外人皮膚表皮細(xì)胞原代分離的方法利于體內(nèi)皮膚再生獲得大量的人皮膚的真皮和表皮細(xì)胞是再生皮膚的第一步,這就需要提高細(xì)胞分離效率和細(xì)胞培養(yǎng)的方法。傳統(tǒng)的分離方法是兩步消化法,此方法耗時長,有一定局限性,本研究提出了一種新的原代分離方法,有效的從皮膚組織中獲得需要細(xì)胞,并且探討了相關(guān)機(jī)制:1.新的分離方法基于Y27632對于真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的不同作用:我們發(fā)現(xiàn)Y27632能促進(jìn)原代表皮細(xì)胞的生長,抑制原代真皮細(xì)胞的生長,通過鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Y27632存在條件下原代真皮細(xì)胞貼壁少并且狀態(tài)明顯不佳。2.Y27632通過阻礙真皮成纖維細(xì)胞的貼壁而抑制真皮細(xì)胞的生長:通過將相同數(shù)量的真皮細(xì)胞接種在正常粘附力和低粘附力的培養(yǎng)皿中培養(yǎng),正常培養(yǎng)皿中加Y27632組真皮細(xì)胞貼壁少并且狀態(tài)不佳,低粘附力培養(yǎng)皿加以外界機(jī)械力搖晃,加Y27632組真皮細(xì)胞因貼壁能力差而更易漂浮。3.Y27632對表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞不同作用的有關(guān)機(jī)制研究:兩種相同數(shù)量的細(xì)胞經(jīng)過Y27632處理后,通過PCR和免疫熒光染色技術(shù)在mRNA和蛋白水平上檢測黏附蛋白和整合素家族的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)表皮細(xì)胞經(jīng)Y27632處理后整合素家族mRNA表達(dá)明顯增高,但是黏附蛋白的mRNA表達(dá)沒有明顯影響;當(dāng)真皮細(xì)胞經(jīng)Y27632處理后整合素家族mRNA表達(dá)沒有明顯影響,但是黏附蛋白的mRNA明顯降低。蛋白水平上通過免疫熒光染色我們發(fā)現(xiàn)加入Y27632后真皮細(xì)胞黏著斑蛋白vinculin陽性表達(dá)量明顯降低,表皮細(xì)胞整合素a 6陽性表達(dá)量升高,說明Y27632能促進(jìn)表皮細(xì)胞貼壁,阻礙真皮細(xì)胞貼壁,我們可以通過是否加入Y27632而從真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的混合液將兩種細(xì)胞分離出來。4.基于Y27632和新型G-培養(yǎng)基我們建立表皮細(xì)胞分離培養(yǎng)的新方法,能夠快速有效的獲得多潛能的表皮細(xì)胞:利用五種培養(yǎng)基培養(yǎng)原代表皮細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)G-培養(yǎng)基最利于表皮細(xì)胞貼壁生長,Y27623結(jié)合G-培養(yǎng)基更加優(yōu)化分離方法;將傳統(tǒng)兩步消化法和新方法比較,我們發(fā)現(xiàn)新方法較傳統(tǒng)兩步消化法一定時間內(nèi)獲得的表皮細(xì)胞數(shù)量更多,且形成細(xì)胞克隆數(shù)量多。新方法獲得的表皮細(xì)胞多潛能性高,當(dāng)與真皮細(xì)胞混合體內(nèi)移植時可以在裸鼠體內(nèi)成功再生出人類皮膚。第二部分改善移植前人皮膚組織細(xì)胞體外培養(yǎng)方法提高人皮膚再生效率我們課題組已利用胚胎組織來源的表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞成功再生出帶有成熟毛發(fā)的人類皮膚,而利用成人組織來源的細(xì)胞再生皮膚仍是一大難題,本部分中我們通過改善移植前胚胎組織來源的表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法來提高皮膚再生成功效率,為將來利用成人組織來源的細(xì)胞再生皮膚奠定技術(shù)基礎(chǔ)。1.表皮細(xì)胞膜片結(jié)合2D貼壁培養(yǎng)的真皮細(xì)胞代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法進(jìn)行體內(nèi)移植:將表皮細(xì)胞提前制作成細(xì)胞膜片,結(jié)合普通2D貼壁培養(yǎng)條件下消化得到的真皮細(xì)胞懸浮液,移植體內(nèi),利用此方法移植20只裸鼠,3個月后其中9只(45%)裸鼠背部皮膚可以再生出帶有毛發(fā)的人類皮膚,其中6只皮膚較大且毛發(fā)較多;HE染色顯示再生組織皮膚組織由表皮組織、真皮組織及皮下組織組成,并可見成熟的毛囊結(jié)構(gòu),類似于人類皮膚;通過人特異性抗體Human Nuclei染色,驗(yàn)證新生皮膚中細(xì)胞主要來源于體外培養(yǎng)移植的表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞。2.表皮細(xì)胞膜片結(jié)合3D懸浮聚合培養(yǎng)的真皮細(xì)胞代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法進(jìn)行體內(nèi)移植:表皮細(xì)胞提前制作成細(xì)胞膜片,結(jié)合3D懸浮聚合培養(yǎng)離心所得的真皮細(xì)胞懸浮液移植體內(nèi)。利用此方法移植40只裸鼠,3個月后其中31只(77.5%)裸鼠背部皮膚可以再生出帶有毛發(fā)的人類皮膚,其中21只皮膚較大且毛發(fā)較多;HE染色顯示再生組織皮膚組織由表皮組織、真皮組織及皮下組織組成,并可見成熟的毛囊結(jié)構(gòu),類似于人類皮膚;通過人特異性抗體Human Nuclei染色,驗(yàn)證新生的皮膚中細(xì)胞主要來源于體外培養(yǎng)移植的表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞。3.表皮細(xì)胞膜片結(jié)合不同培養(yǎng)條件下的真皮細(xì)胞體內(nèi)移植方法的比較:通過以上兩種方法的比較我們發(fā)現(xiàn),表皮細(xì)胞膜片結(jié)合3D懸浮聚合培養(yǎng)的真皮細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植能夠更加有效的再生人類皮膚,并且形成毛發(fā)更多;通過熒光實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)分析我們發(fā)現(xiàn)3D懸浮聚合培養(yǎng)的真皮細(xì)胞Wnt5a和Versican的mRNA表達(dá)量明顯高于2D貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞Wnt5a和Versican的mRNA表達(dá)量,綜上說明懸浮聚合3D培養(yǎng)的真皮細(xì)胞比普通貼壁2D培養(yǎng)的真皮細(xì)胞具有更高的促進(jìn)毛發(fā)再生的能力,前者結(jié)合表皮細(xì)胞膜片時再生帶有毛發(fā)的人類皮膚成功率更高。第三部分探討再生皮膚模型的應(yīng)用之一:創(chuàng)傷皮膚模型的建立皮膚創(chuàng)傷愈合過程中真皮重塑、瘢痕形成等的研究對臨床有著重要的意義,但目前仍沒有理想的體內(nèi)動物模型來研究人類皮膚創(chuàng)傷的愈合過程,小鼠皮膚結(jié)構(gòu)和創(chuàng)傷愈合過程與人類皮膚相差很大,不能真實(shí)的反映人類皮膚愈合情況,應(yīng)用研究有一定局限性。因此建立良好的體內(nèi)皮膚創(chuàng)傷模型對于了解創(chuàng)傷愈合的過程以及改善治療方案有著重要作用。本部分在人類皮膚模型的基礎(chǔ)上構(gòu)建了皮膚創(chuàng)傷模型。1.基于再生皮膚的皮膚創(chuàng)傷模型成功構(gòu)建:分別于裸鼠背部皮膚和3個月的再生皮膚做直徑2mm的創(chuàng)傷,通過肉眼觀察和組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)裸鼠皮膚1周左右創(chuàng)傷基本愈合,再生皮膚2周左右創(chuàng)傷基本愈合,8周時愈合表皮分層明顯,真皮層基質(zhì)較多,但仍處于真皮構(gòu)建過程中,此過程是之前文獻(xiàn)所沒有報道過的。2.驗(yàn)證新生皮膚的表皮層能夠正常分化:通過表皮層分化相關(guān)因子(K5,K10,Loricrin)免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)再生皮膚創(chuàng)傷之后新生的表皮能正常發(fā)生分化,恢復(fù)正常功能,進(jìn)一步證明再生皮膚創(chuàng)傷后能自行愈合。3.驗(yàn)證新生皮膚的表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞來源于人類細(xì)胞:通過免疫熒光染色所示創(chuàng)傷處修復(fù)皮膚的表皮細(xì)胞呈現(xiàn)Pan-ck陽性表達(dá),這代表新生皮膚的表皮細(xì)胞來源于人的表皮細(xì)胞;修復(fù)皮膚的真皮層細(xì)胞主要表達(dá)Vimentin陽性,代表新生皮膚的真皮細(xì)胞主要來源于人的真皮細(xì)胞;新生表皮中約有98%表皮細(xì)胞呈現(xiàn)HuNuclei陽性表達(dá),但是新生真皮中由HuNuclei陽性表達(dá)細(xì)胞和部分HuNuclei陰性表達(dá)細(xì)胞組成,真皮組織中也存在著鼠源性的免疫細(xì)胞,以上數(shù)據(jù)表明新生皮膚的表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞主要來源于移植的體外培養(yǎng)的人的細(xì)胞,愈合過程接近正常皮膚的愈合過程。4.此皮膚創(chuàng)傷模型為研究創(chuàng)傷愈合過程的相關(guān)機(jī)理提供了良好的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ):我們通過GFP標(biāo)記表皮細(xì)胞或真皮細(xì)胞從而構(gòu)建出帶有綠色熒光蛋白的再生皮膚,經(jīng)創(chuàng)傷處理后發(fā)現(xiàn)愈合過程同未標(biāo)記的再生皮膚愈合過程相同,并且通過免疫組化觀察發(fā)現(xiàn)新生皮膚的表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞來源于移植的帶有綠色熒光蛋白的人的表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞。
[Abstract]:In addition to the tongue , lip , cheek , salivary gland and other parts of oral and maxillofacial tumors , facial skin tumors can not be ignored , and skin tumor excision or skin trauma can cause skin defects . After skin injury , the wound is recovered by epidermal or scar contraction from the edge of the wound , which affects the appearance of the patient or the defect of the anatomical structure . The present invention provides a new method for separating skin from human skin , which can be used for repairing or replacing skin defect caused by disease , trauma , aging , etc . In this part , we found that G - culture medium is the most beneficial to epidermal cell adherent growth , and it can be used to regenerate skin cells . Skin wound model was established on the basis of human skin model .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R782

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