本文選題：阿爾茨海默病 + 淀粉樣前體蛋白�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景:阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種以進(jìn)行性的認(rèn)知障礙、記憶力減退和性格行為改變等癥狀為主的影響老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD由于嚴(yán)重影響患者的生活能力,重癥患者甚至日常生活不能自理,給患者家庭和整個(gè)社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。AD的典型特征是在腦中沉積的β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid peptide,Aβ),Aβ是通過(guò)淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)的蛋白裂解產(chǎn)生。眾多證據(jù)表明線粒體的功能異常對(duì)AD的發(fā)病起到了關(guān)鍵作用。體內(nèi)和體外研究支持線粒體在APP代謝和細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)中起的重要作用。近年來(lái),作為線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子家族成員之一的線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子4(mitochondrial transcription termination factor 4,MTERF4)被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)線粒體DNA轉(zhuǎn)錄和直接控制線粒體核糖體翻譯的功能。MTERF4可能通過(guò)對(duì)線粒體功能的調(diào)節(jié)因而和AD的發(fā)病相關(guān)。目的:本研究觀察MTERF4在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中的表達(dá)情況,進(jìn)一步研究MTERF4過(guò)表達(dá)與敲低在體外對(duì)APP代謝途徑的影響與機(jī)制,揭示MTERF4在AD發(fā)病機(jī)制中的作用。方法:利用Western blot技術(shù)檢測(cè)MTERF4在6月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中及同月齡野生對(duì)照小鼠海馬組織中的表達(dá)情況。用分子克隆技術(shù),構(gòu)建pc DNA-MTERF4真核表達(dá)載體和p GPH1/GFP/Neo-MTERF4干擾載體。培養(yǎng)HEK293-APPswe細(xì)胞,分別將構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體和RNA干擾載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,采用Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中MTERF4、APP、C99、C83、ADAM10和BACE1的蛋白表達(dá)水平。用Trizol法提取細(xì)胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成c DNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),觀察MTERF4、APP、ADAM10和BACE1基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)。構(gòu)建含有ADAM10啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒p GL3-ADAM10,將pc DNA-MTERF4與p GL3-ADAM10共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中,用海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參,通過(guò)對(duì)重組質(zhì)粒表達(dá)熒光素酶活性的分析,確定過(guò)表達(dá)MTERF4對(duì)ADAM10基因啟動(dòng)子活性的影響。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)來(lái)檢測(cè)分泌到細(xì)胞外的Aβ42的生成量。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)MTERF4過(guò)表達(dá)與敲低時(shí)的細(xì)胞周期情況。CCK-8法檢測(cè)MTERF4過(guò)表達(dá)與敲低對(duì)HEK293-APPswe細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬組織中MTERF4蛋白表達(dá)水平增加68%。成功構(gòu)建針對(duì)MTERF4基因的pc DNA-MTERF4過(guò)表達(dá)載體和p GPH1/GFP/Neo-MTERF4干擾載體。與對(duì)照組相比,將重組質(zhì)粒pc DNA-MTERF4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293-APPswe細(xì)胞24和48小時(shí),MTERF4蛋白水平分別顯著增加了67%和258%。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,pc DNA-MTERF4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中MTERF4 m RNA水平在24和48小時(shí)增加235和216倍。MTERF4的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)了HEK293-APPswe細(xì)胞中APP蛋白和胞外分泌的Aβ42水平的顯著增加。另外,APP蛋白切割加工產(chǎn)生的C99水平升高37%、C83水平降低27%,表明MTERF4過(guò)表達(dá)抑制了APP蛋白的α-切割而促進(jìn)了β切割。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,MTERF4過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中的ADAM10 m RNA水平在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后降低68%。Western blot檢測(cè)顯示MTERF4的過(guò)表達(dá)抑制ADAM10的蛋白表達(dá)(下降27%)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)MTERF4蛋白可抑制ADAM10基因啟動(dòng)子區(qū)域的啟動(dòng)子活性。MTERF4過(guò)表達(dá)不影響HEK293-APPswe細(xì)胞的周期分布和細(xì)胞增殖。在HEK293-APPswe細(xì)胞中利用p GPH1/GFP/Neo-MTERF4質(zhì)粒干擾MTERF4基因的表達(dá)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293-APPswe細(xì)胞24和48小時(shí),MTERF4蛋白水平分別降低了9%和36%。定量實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示,MTERF4敲低的細(xì)胞中MTERF4 m RNA水平在24和48小時(shí)降低19%和66%。與對(duì)照組相比,敲低MTERF4 48小時(shí)后細(xì)胞中APP蛋白表達(dá)水平降低26%,胞外Aβ42水平降低24%。同時(shí)APP代謝產(chǎn)物C99和C83水平分別降低19%和32%。干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后,細(xì)胞中ADAM10蛋白水平降低了26%,而在24小時(shí)細(xì)胞中ADAM10蛋白水平無(wú)明顯變化。與對(duì)照組相比,在MTERF4敲低24和48小時(shí)后,細(xì)胞中ADAM10 m RNA表達(dá)分別降低21%和51%。敲低MTERF4 24和48小時(shí),細(xì)胞周期在G0/G1期的細(xì)胞百分比減少、S期細(xì)胞百分比增加,G2/M期細(xì)胞百分比無(wú)明顯差異。干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后,與對(duì)照組相比較細(xì)胞增殖降低11%。結(jié)論:MTERF4蛋白表達(dá)在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中上調(diào)。在體外該基因過(guò)表達(dá)增加了HEK293-APPswe細(xì)胞中APP蛋白水平并通過(guò)抑制α-分泌酶ADAM10促進(jìn)APP的淀粉樣蛋白形成加工。敲低MTERF4表達(dá)則通過(guò)抑制細(xì)胞中APP表達(dá)降低淀粉樣蛋白形成加工,并對(duì)APP和ADAM10基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都具有下調(diào)作用。另外,敲低MTERF4表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖具有一定的影響。這些結(jié)果表明MTERF4對(duì)引發(fā)AD的APP表達(dá)及代謝通路具有調(diào)控作用,兩者呈正相關(guān)關(guān)系。MTERF4可能在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,該機(jī)制為探索AD的治療方法提供了新思路。
[Abstract]:BACKGROUND : Alzheimer ' s disease ( AD ) is a kind of degenerative disease of the central nervous system affected by progressive cognitive impairment , hypomnesis , and change of personality behavior . Western blot analysis showed that MTERF4 overexpression inhibited the expression of MTERF4 in 24 and 48 hours after transfection .
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2028708