發(fā)布時間：2018-06-12 03:47

  本文選題：慢性乙型肝炎 + 調節(jié)性T細胞　； 參考：《河北醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：背景:慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染仍是世界性的公共衛(wèi)生問題,是導致肝硬化、肝細胞癌等終末期肝病的重要原因。宿主HBV特異性T細胞免疫應答在病毒的控制清除和肝臟炎癥損傷中發(fā)揮著核心作用,決定了HBV感染的最終轉歸。急性自限性HBV感染時,機體具備強烈、廣泛、多克隆的特異性T細胞應答,并在病毒清除后形成免疫記憶。但是,慢性HBV感染時,由于高濃度HBV抗原刺激等原因,HBV特異性T細胞呈現數量減少和功能耗竭,從而導致了持續(xù)感染。T細胞耗竭主要表現為分泌效應細胞因子、細胞增殖等功能障礙和細胞凋亡增加。目前認為,引起HBV特異性T細胞耗竭的主要機制包括:暴露于高病毒抗原中、程序性死亡受體1等共抑制分子表達上調、抑制性細胞因子分泌增多和調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)的抑制作用等等。因此,最大程度恢復耗竭的HBV特異性T細胞功能是清除慢性HBV感染的關鍵。1型調節(jié)性T細胞(type 1 regulatory T cells,Tr1)是一種由外周CD4~+T細胞經抗原誘導分化而來,具有促進機體免疫耐受和維持免疫穩(wěn)態(tài)功能的細胞亞群。Tr1的表型為共表達整合素α2β1(integrinα2β1,CD49b)和淋巴細胞活化基因3(lymphocyte activation gene-3,LAG-3)的記憶性CD4~+T細胞,并具有特有的細胞因子表達譜和代謝轉錄組學特點。目前認為,Tr1主要通過分泌高濃度白細胞介素(interleukin,IL)10和釋放顆粒酶B介導特異性抗原抑制功能,并廣泛參與了自身免疫病、移植物排異、病原體感染和腫瘤細胞免疫逃逸T細胞介導的疾病。在HBV小鼠模型中,肝內HBV特異性Tr1通過分泌IL-10,抑制淋巴結生發(fā)中心內濾泡輔助性T細胞和B細胞的成熟,從而介導了HBV特異性免疫耐受。雖然有研究發(fā)現HBV特異性IL-10+Tr1不能作為區(qū)分HBV自然史不同分期的免疫標記,但用IL-10+細胞定義Tr1存在方法學上的不足,故難以真實反映Tr1在慢性HBV感染中的實際意義。因此,探索Tr1對HBV特異性T細胞應答的抑制作用和機制,尋找潛在的恢復T細胞耗竭的免疫調節(jié)治療靶點具有重要意義。第一部分tr1在慢性hbv感染自然史和抗病毒治療中的變化及意義目的:橫斷面比較慢性hbv感染自然史不同時期患者外周血和肝內tr1頻率的差異及組織分布特點,分析其與hbvdna、病毒抗原水平、肝臟炎癥和纖維化程度等臨床指標間的關系,并縱向觀察抗病毒治療對tr1數量的影響,以期揭示tr1在慢性hbv感染中可能具有的臨床意義。方法:1橫斷面研究中入選未經抗病毒治療的慢性hbv感染者共110例,包括免疫耐受(immunetolerant,it)期21例,hbeag+免疫活動(immuneactive,ia)期46例,非活動性攜帶(inactivecarrier,ic)期24例,hbeag ia期19例。同時納入23例健康志愿者作為健康對照。縱向研究納入15例接受聚乙二醇干擾素α2a聯合恩替卡韋初始抗病毒治療的hbeag+ia期患者。慢性hbv感染的診斷需符合2015年美國肝病學會頒布的《慢性乙型肝炎治療指南》的標準。所有研究對象留取外周抗凝血,部分患者接受肝組織活檢。2檢測血清病毒學標志物、hbvdna、hbv基因型、肝生化學等臨床指標。肝組織病理切片經he和masson染色后,利用knodell和ishak評分對炎癥活動和纖維化進行評估。3從血液和肝組織標本中分離外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcells,pbmc)和肝內淋巴細胞(intrahepaticlymphocyte,ihl)。應用多色流式細胞術檢測pbmc和ihl中cd49b~+lag-3~+tr1的頻率,并分析其與臨床指標的相關性。4利用免疫組織化學染色技術觀察肝內lag-3在慢性hbv感染自然史各期患者中的表達差異和分布位置特點,并進一步探討lag-3與cd4分子的空間依存關系。結果:1橫斷面研究對象的人口學和臨床資料所有入選患者感染hbv均為基因b型或c型。it期和hbeag+ia期患者相對于ic期和hbeag ia期患者更年輕。it期和ic期患者血清丙氨酸氨基轉移酶(alanineaminotransferase,alt)正常,肝臟無明顯炎癥,但hbeag+ia和hbeag ia期患者出現不同程度的alt升高,肝組織可見明顯的炎癥和不同程度的纖維化。it期和hbeag+ia期患者hbvdna復制活躍,ic期患者hbvdna處于低復制或不可測水平。ic期患者的血清hbsag水平較it期和hbeag+ia患者顯著下降,而hbeag ia期患者介于三者之間。2外周血cd49b~+lag-3~+tr1頻率及與臨床指標的相關性慢性hbv感染者外周血cd49b~+lag-3~+tr1頻率顯著高于健康對照者(p0.0001)。ic期患者外周血tr1頻率顯著低于it期和hbeag+ia期患者(均p0.0001)。tr1頻率在it期和hbeag+ia期患者間無統(tǒng)計學差異,但兩者均顯著高于hbeag ia期患者(p=0.004和p=0.005)。根據hbeag狀態(tài)分層,hbeag+患者外周血tr1明顯高于hbeag 患者(p0.0001)。此外,未發(fā)現tr1頻率存在性別間的差異。相關性分析顯示,外周血tr1頻率與血清hbvdna和hbsag水平呈正相關(r=0.543,p0.001和r=0.582,p0.001),但與血清alt、hbeag水平和肝組織炎癥、纖維化評分無相關性。3肝內tr1的頻率及l(fā)ag-3、cd4分子的空間定位關系tr1在慢性hbv感染者ihl中的頻率明顯高于pbmc(p=0.005)。免疫組化顯示,ic期患者肝內lag-3表達顯著少于hbeag+ia期、hbeag ia期和it期患者,主要表達在匯管區(qū)、小葉內的炎癥壞死灶和肝竇內,連續(xù)切片亦發(fā)現cd4和lag-3分子的陽性表達在同一區(qū)域內有部分重疊。4外周血tr1頻率在抗病毒治療過程中的變化趨勢在接受抗病毒治療的15例患者中,外周血tr1頻率在治療48周時較基線和12周有明顯下降(p=0.01和p=0.03)。治療48周時,外周血tr1與治療前的差值,在hbsag較基線下降≥0.5log的患者中顯著高于hbsag下降0.5log的患者(p=0.018)。同時,tr1在治療期間的下降幅度與hbsag下降幅度具有相關性(r=0.662,p=0.007)。小結:1慢性hbv感染者外周血tr1數量增加,提示tr1可能在hbv持續(xù)性感染的形成中發(fā)揮了一定作用。2tr1在慢性hbv感染自然史不同分期間具有顯著差異,尤其在it和hbeag+ia期顯著高于ic期,反映了病毒復制能力和宿主免疫耐受程度,可作為臨床判別自然史分期的一個較有意義的免疫學標志物。3chb患者抗病毒治療中,tr1的下降與病毒抑制后hbsag的降低具有一定聯系,故有可能成為潛在的預測抗病毒治療應答的免疫學指標。第二部分慢性hbv感染者外周血tr1的細胞因子表達譜目的:分析tr1在慢性hbv感染背景下的細胞因子表達譜特點。方法:利用流式分選hbeag+ia期患者外周血cd49b~+lag-3~+tr1、cd4+cd45ra cd49b lag-3 t和cd4~+cd45ra~+t共三群細胞,在體外經佛波醇酯和離子霉素刺激后,利用流式多因子技術檢測上清液中il-4、il-10、il-17a、干擾素γ(interferonγ,ifn-γ)和腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactorα,tnf-α)的水平。結果:cd49b~+lag-3~+tr1分泌il-10的水平顯著高于cd49b lag-3 t細胞(p=0.02)和cd4~+cd45ra~+t細胞(p=0.03),但在后兩者間無統(tǒng)計學差異。ifn-γ分泌水平在cd49b~+lag-3~+tr1中顯著低于cd49b lag-3 t細胞(p=0.02),然而與cd4~+cd45ra~+t細胞比較無統(tǒng)計學差異。cd49b~+lag-3~+tr1能分泌少量的tnf-α、il-17a和il-4,均顯著低于cd49b lag-3 t細胞(p=0.01;p=0.0002;p=0.001),但cd4~+cd45ra~+t細胞不分泌或僅分泌低水平的il-17a和il-4。聚類分析也證實,基于該細胞因子表達譜可以將tr1與cd49b lag-3 t細胞和cd4~+cd45ra~+t細胞進行區(qū)分。小結:1慢性hbv感染者外周血cd49b~+lag-3~+tr1具有以分泌il-10為主的細胞因子譜,并顯著區(qū)別于其它記憶性和初始cd4+t細胞亞群。2tr1分泌的il-10可能參與調控慢性hbv感染免疫應答,但尚需進一步研究證實。第三部分tr1對hbv特異性t細胞的抑制功能和機制目的:評價tr1對hbv特異性t細胞分泌細胞因子和細胞增殖功能的影響,并探索il-10作為可能機制在tr1介導的hbv特異性t細胞功能抑制中發(fā)揮的作用。方法:利用流式分選技術將hbeag+ia期患者外周血cd49b~+lag-3~+tr1從pbmc中刪除,剩余細胞命名為反應細胞(respondercells,rc),并進一步分為rc+tr1和rc兩組,在體外經hbv抗原肽庫或cef抗原肽庫(來自巨細胞病毒、eb病毒和流感病毒)刺激進行富集培養(yǎng)。用酶聯免疫斑點測定(enzyme-linkedimmunospotassay,elisopt)技術和胞內細胞因子染色(intracellularcytokinestaining,ics)技術檢測cd4+t細胞和cd8+t細胞分泌ifn-γ和tnf-α的水平,同時用cfse染色觀察cd8+t細胞的增殖能力,評價tr1對hbv特異性t細胞功能的抑制作用。此外,利用il-10抗體阻斷技術,探索tr1對hbv特異性t細胞分泌細胞因子和細胞增殖功能的影響。結果:1tr1對hbv特異性cd8+t細胞分泌ifn-γ和tnf-α的抑制作用elispot結果顯示,經hbv抗原肽庫刺激后,rc中ifn-γ+細胞斑點數較rc+tr1明顯增多,差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.014)。ics結果進一步發(fā)現,rc中hbv特異性ifn-γ+cd8+t細胞和tnf-α+cd8+t細胞頻率較rc+tr1明顯增多,差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.006和p=0.034),但是刪除tr1后并未顯著提升hbv特異性cd4+t細胞分泌ifn-γ和tnf-α的功能。此外,tr1經cef抗原肽庫刺激后,cd4+t細胞和cd8+t細胞分泌細胞因子的功能在rc與rc+tr1間無顯著差異。2tr1對cd8+t細胞增殖的抑制作用cfse增殖實驗的結果顯示,刪除tr1后rc中cd8+t細胞的未增殖率較rc+tr1顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.009)。我們進一步選取1例慢性hbv感染者,分選其外周血tr1和cd8+t細胞,并將兩者按0:1、1:4、1:2等不同比例進行共培養(yǎng),結果發(fā)現cd8+t細胞的增殖指數逐漸降低,依次為3.00、1.85和1.45,提示tr1對cd8+t細胞的抑制作用具有劑量依賴性。3阻斷il-10能部分恢復tr1對cd8+t細胞功能的抑制作用經il-10抗體阻斷后,hbv特異性cd8+t細胞分泌ifn-γ和tnf-α較同型對照明顯增多(均p0.05),這種阻斷效應尤其在rc+tr1中較rc更為顯著(ifn-γ升高倍數:1.73±0.53vs1.16±0.10,p=0.01;tnf-α升高倍數:1.94±1.10vs1.46±0.50,p=0.039),而cef抗原肽庫刺激雖能部分增強cd8+t細胞分泌ifn-γ和tnf-α的能力(均p0.05),但改善程度在兩組間無顯著差異,提示tr1分泌的il-10對hbv特異性cd8+t細胞分泌ifn-γ和tnf-α具有抑制作用。此外,無論是在rc+tr1還是rc中,il-10阻斷使cd8+t細胞的未增殖率較同型對照均顯著降低(均p=0.006)。雖然il-10阻斷在rc+tr1中的恢復程度高于rc,但尚不具有統(tǒng)計學差異。小結:1慢性hbv感染者外周血tr1能顯著抑制hbv特異性cd8+t細胞的細胞因子分泌和增殖功能。2特異性阻斷il-10能部分恢復tr1對hbv特異性cd8+t細胞功能的抑制作用。第四部分慢性hbv感染時cd49b在cd8+t細胞上的表達及意義目的:觀察慢性hbv感染者外周血和肝內cd49b+cd8+t細胞的表達數量及與疾病間的關系,并分析其活化和記憶性的特點。方法:基于第一部分研究中的橫斷面自然史隊列,納入慢性hbv感染者76例(it期12例、hbeag+ia期25例、ic期23例和hbeag ia期16例)和健康對照者23例。利用流式細胞術檢測pbmc和ihl中cd49b+cd8+t細胞的頻率及其與臨床指標的相關性,分析cd49b+cd8+t細胞中cd45a表達與cd49b cd8+t和總cd8+t細胞的表達差異。利用免疫組織化學染色技術觀察肝內cd49b的表達定位和與cd8的空間關系。結果:1慢性hbv感染自然史各期患者外周血cd49b+cd8+t細胞頻率慢性hbv感染者外周血cd49b+cd8+t細胞占cd3+cd8+t細胞頻率高于健康對照者(p=0.0003)。hbeag+ia期和hbeag ia期患者,外周血cd49b+cd8+t細胞頻率均顯著高于it期(p=0.002和p=0.004)和ic期(p=0.016和p=0.027),但前兩者間和后兩者間分別比較均無統(tǒng)計學差異。此外,具有肝炎活動的患者(hbeag+ia期和hbeag ia期),與無炎癥活動的患者(it期和ic期)比較,外周血cd49b+cd8+t細胞頻率在前者顯著高于后者(p=0.0003)。根據hbeag狀態(tài)和性別分層,未見cd49b+cd8+t細胞頻率有統(tǒng)計學差異。2外周血cd49b+cd8+t細胞頻率與臨床指標的相關性外周血cd49b+cd8+t細胞頻率與血清alt和天冬氨酸氨基轉移酶水平正相關(r=0.39,p=0.0005和r=0.32,p=0.005),但與血清hbvdna和hbsag水平無相關性。此外,在接受肝活檢的患者中,外周血cd49b+cd8+t細胞頻率與肝臟knodell評分(r=0.497,p=0.001)和ishak評分(r=0.353,p=0.025)正相關。3cd49b+cd8+t細胞表達cd45ra的水平在hbeag+ia期患者中,cd49b+cd8+t細胞中cd45ra+t細胞頻率顯著低于cd8+cd49b t細胞(p=0.022)和總cd8+t細胞(p=0.025)。此外,cd45ra t細胞與cd45ra+t細胞頻率的比值在cd49b+cd8+t細胞中顯著高于cd8+cd49b t細胞(p=0.026)和總cd8+t細胞(p=0.015)。4cd49b+cd8+t細胞在肝內的數量及分布特點cd49b+cd8+t細胞在ihl中的頻率顯著高于pbmc(p=0.0007)。免疫組化顯示,hbeag+ia期和hbeag ia期患者肝內cd49b表達顯著增多,而it期和ic期患者則僅有少許表達。cd49b的表達部位主要在炎癥細胞聚集的匯管區(qū)、小葉內的炎癥壞死灶中,同時可觀察到有類似纖維組織從匯管區(qū)向小葉內延伸的現象;連續(xù)肝組織切片可檢測到cd49b和cd8陽性表達出現在同一區(qū)域內,提示兩者可能存在共表達現象。小結:1慢性hbv感染者外周血cd49b+cd8+t細胞增多,與肝臟炎癥損傷程度密切相關,同時具有從外周向肝內遷移的特點,但具體機制仍需進一步探討。2慢性hbv感染患者增多的cd49b+cd8+t細胞主要為活化或記憶性cd8+t細胞。結論:1慢性hbv感染自然史不同分期患者tr1的數量和分布具有差異,并反映了病毒復制能力和宿主免疫耐受程度,有可能成為臨床判別自然史分期的一個潛在的有意義的免疫學標志物。2慢性hbv感染者外周血tr1具有以分泌il-10為主,并具有明顯區(qū)別于其它初始和記憶性cd4+t細胞亞群的細胞因子表達譜。3tr1通過分泌il-10介導了hbv特異性t細胞的功能抑制,可能是慢性hbv感染后免疫耐受形成的機制之一。4靶向阻斷tr1的抑制作用有可能成為逆轉hbv特異性t細胞功能耗竭的潛在免疫治療策略。5 CD49b是具有抑制性細胞Tr1的重要表面標記,但表達CD49b的CD8+T細胞在慢性HBV感染時主要介導肝臟的免疫病理損傷。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R512.62

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本文編號：2008191