本文選題：CCDC88A蛋白 + Dlg5蛋白�。� 參考：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：[目的]肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)侵襲和轉(zhuǎn)移是制約其預(yù)后的重要因素,而侵襲性偽足(invadopodia)形成及發(fā)揮基質(zhì)降解功能是HCC侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵早期事件。然而,目前調(diào)節(jié)侵襲性偽足形成的分子機(jī)制仍不完全清楚。帶有5個SH3域的酪氨酸激酶底物(tyrosine kinase substrate with five SH3 domains,Tks5)是侵襲性偽足關(guān)鍵支架蛋白,Src介導(dǎo)的Tks5酪氨酸557/619位點(mTks5-Y557/619,相當(dāng)于hTks5-Y530/Y592)磷酸化可促進(jìn)侵襲性偽足相關(guān)蛋白招募,最終形成侵襲性偽足。成蟲大盤基因類似物5(discs large homolog 5,Dlg5)是膜相關(guān)鳥苷酸激酶家族成員,既往研究顯示Dlg5對維持粘附連接及上皮細(xì)胞極性重要,且Dlg5在多種侵襲性腫瘤表達(dá)下調(diào),但其調(diào)控癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究較少。近期研究顯示在前列腺癌PC-3及腎上皮LLc-PK1細(xì)胞中Dlg5可與肌動蛋白纖絲橋梁蛋白(Girders of actin filament,Girdin)結(jié)合,抑制 Akt 介導(dǎo)的 Girdin 絲氨酸 1416位點磷酸化。由于Girdin定位于小鼠NIH3T3-Src-Y527F細(xì)胞侵襲性偽足,且Girdin對FAK酪氨酸397和Src酪氨酸418位點磷酸化必須,后兩者涉均及Tks5活化及侵襲性偽足產(chǎn)生,我們推測Dlg5可能通過一種涉及Girdin、Tks5的機(jī)制調(diào)控侵襲性偽足的形成及功能。本課題旨在研究:1、HCC及癌旁組織中Dlg5是否存在表達(dá)差異,及HCC組織中Dlg5低(高)表達(dá)是否對臨床指標(biāo)產(chǎn)生影響;2、HCC細(xì)胞中Dlg5是否通過調(diào)控Girdin及Tks5相互作用及活化調(diào)控侵襲性偽足形成和發(fā)揮功能;3、進(jìn)而Dlg5是否影響體外HCC侵襲及體內(nèi)HCC生長和轉(zhuǎn)移。[方法]1、臨床組織水平研究:收集昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2008年至2009年病例資料完整、術(shù)前未行其他腫瘤治療的HCC及對應(yīng)癌旁標(biāo)本100例,隨訪至2015年底,應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測上述標(biāo)本中Dlg5蛋白表達(dá),臨床關(guān)聯(lián)分析/分層分析Dlg5蛋白表達(dá)高低與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性及對預(yù)后的影響。2、體外細(xì)胞表型研究:(1)人永生化正常肝細(xì)胞系HL-7702,人肝癌細(xì)胞系 HepG2,SMMC-7721,SK-Hepl,及 MHCC97-L 常規(guī)培養(yǎng)。應(yīng)用 Western blot技術(shù)檢測上述細(xì)胞系中Dlg5蛋白表達(dá)。(2)采用 pLKD-CMV-PuroR-U6-Dlg5-shRNA 慢病毒穩(wěn)定敲減 HepG2 細(xì)胞中 Dlg5 表達(dá),pLKD-CMV-PuroR-U6-Ctrl-shRNA 作為對照;應(yīng)用 Western blot、倒置相差顯微鏡技術(shù)檢測Dlg5敲減對HepG2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)及細(xì)胞形態(tài)的影響;應(yīng)用免疫熒光共定位顯微技術(shù)檢測Dlg5敲減對HepG2細(xì)胞侵襲性偽足形成、明膠降解功能的影響;應(yīng)用Transwell Matrix侵襲實驗檢測Dlg5敲減對HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響。侵襲性偽足形成定義為Tks5或Cortactin(在Tks5敲減時)與F-actin共定位點;侵襲性偽足相關(guān)明膠降解定義為F-actin與熒光明膠降解區(qū)域共定位點。(3)采用pcDNA3.1(+)-Dlg5過表達(dá)質(zhì)粒陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SK-Hepl細(xì)胞,pcDNA3.1(+)空載體為對照,應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測Dlg5過表達(dá)對SK-Hep1細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;應(yīng)用免疫熒光共定位顯微技術(shù)檢測Dlg5過表達(dá)對SK-Hep1細(xì)胞侵襲性偽足形成、明膠降解功能的影響;應(yīng)用Transwell Matrix侵襲實驗檢測Dlg5過表達(dá)對SK-Hep1細(xì)胞侵襲能力的影響;應(yīng)用MTT繪制生存曲線。(4)在上述HepG2/shDlg5及HepG2/shCtrl細(xì)胞,采用pLKO.1-Neo-Girdin-shRNA 及 pLKO.1-Neo-Tks5-shRNA 慢病毒感染分別敲減Girdin及Tks5表達(dá),pLKO.1-Neo-Ctrl-shRNA作為為對照;同時采用搭載shRNA抵抗的Girdin、Tks5、或磷酸化缺陷變異Tks5-Y530/592F cDNA的腺病毒(pDC316穿梭質(zhì)粒構(gòu)建)或空載體腺病毒感染挽救或不挽救上述對應(yīng)細(xì)胞Girdin 或 Tks5 表達(dá),采用 Western blot 檢測上述細(xì)胞 Dlg5、Tks5 或 Girdin、β-tubulin表達(dá),采用免疫共沉淀檢測Tks5酪氨酸磷酸化水平,利用免疫熒光共定位顯微技術(shù)及Transwell Matrix侵襲實驗分別檢測侵襲性偽足形成、明膠降解功能、及細(xì)胞侵襲能力的改變。3、體外分子機(jī)制研究:(1)在HepG2/shDlg5及HepG2/shCtrl細(xì)胞,感染搭載shRNA抵抗的Dlg5 cDNA的腺病毒(pDC316穿梭質(zhì)粒構(gòu)建)或空載體腺病毒,采用免疫共沉淀技術(shù)、免疫熒光共定位顯微技術(shù),檢測Dlg5、Girdn、Tks5三種分子間相互作用關(guān)系;(2)在HepG2/shDlg5及HepG2/shCtrl細(xì)胞,采用pLKO.1-Neo-Girdin-shRNA慢病毒敲減Girdin表達(dá),pLKO.1-Neo-Ctrl-shRNA作為為對照,同時采用搭載shRNA抵抗的Girdin cDNA的腺病毒(pDC316穿梭質(zhì)粒構(gòu)建)或空載體腺病毒感染挽救或不挽救上述細(xì)胞Girdin表達(dá),采用免疫共沉淀技術(shù),檢測Dlg5敲減對Girdin、Tks5、FAK、Src關(guān)鍵位點磷酸化影響,及Dlg5敲減后Girdin對Tks5、FAK、Src關(guān)鍵酪氨酸磷酸化影響。在HepG2/shDlg5及HepG2/shCtrl細(xì)胞,使用FAK、Src特異性抑制劑(PF-573228及SU-6656)處理,DMSO為對照,采用免疫共沉淀技術(shù),檢測FAK、Src磷酸化活化對Tks5酪氨酸磷酸化影響。(3)在 HepG2/Dlg5 及 HepG2/Ctrl 細(xì)胞,不同濃度(0、5ng/ml、或 10ng/ml)TGF-β1處理72h,采用Western blot技術(shù)檢測Dlg5表達(dá),免疫共沉淀技術(shù)再次驗證 Dlg5、Girdin、Tks5 三者相互作用關(guān)系,及 Dlg5 對 Girdin、Tks5、FAK、Src關(guān)鍵位點磷酸化影響。4、體內(nèi)研究:采用Dlg5穩(wěn)定過表達(dá)或空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SK-Hep1細(xì)胞建立BALB/c裸鼠原位移植瘤模型。飼喂35天后,采用PET/CT、組織學(xué)技術(shù)檢測Dlg5表達(dá)對裸鼠原位肝癌移植瘤肝肺轉(zhuǎn)移及生長能力的影響。[結(jié)果]1、臨床組織水平研究:(1)免疫組織化學(xué)檢測顯示人HCC組織中Dlg5蛋白表達(dá)低于癌旁組織(半定量結(jié)果中等-強表達(dá)/無-弱表達(dá):癌28/72 vs.癌旁70/30,P0.001)。(2)臨床關(guān)聯(lián)分析顯示HCC中Dlg5表達(dá)降低與腫瘤結(jié)節(jié)增加(≥2多結(jié)節(jié)/單結(jié)節(jié):高表達(dá)6/22 vs.低表達(dá)32/40,P= 0.033)、血管侵犯(侵犯/未侵犯:高表達(dá)5/23 vs.低表達(dá)29/43,P=0.034)、細(xì)胞分級(EdmondsonⅢ-Ⅳ/ⅠⅡ:高表達(dá) 4/24 vs.低表達(dá) 31/41,P=0.007)和 TNM 分期(TNM Ⅲ-Ⅳ/Ⅰ-Ⅱ:高表達(dá)2/26 vs.低表達(dá)25/47,P= 0.005)增高,及較差的總生存率(中位總生存期:高表達(dá)69個月vs.低表達(dá)20個月,P = 0.010)和無病生存率(中位無病生存期:高表達(dá)48個月vs.低表達(dá)16個月,P=0.017)密切相關(guān)。2、體外細(xì)胞表型研究:(1)人HCC細(xì)胞系中Dlg5蛋白表達(dá)較正常肝細(xì)胞系低,且高侵襲性HCC細(xì)胞系(SK-Hep1、MHCC97L)中Dlg5蛋白表達(dá)較低侵襲性HCC細(xì)胞系(HepG2、SMMC-7721)低。(2)在HepG2細(xì)胞,Dlg5下調(diào)造成上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)下降,間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)和Fibronectin表達(dá)增加,細(xì)胞形態(tài)由鵝卵石樣向成纖維細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變;同時Dlg5下調(diào)促進(jìn)侵襲性偽足形成:含有侵襲性偽足的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)從對照組平均值5%上升至Dlg5敲減時20%～25%(P0.05),每個細(xì)胞侵襲性偽足數(shù)目從對照組平均值0.3上升至Dlg5敲減時1.5-1.8(P0.05);促進(jìn)侵襲性偽足功能成熟:帶有明膠降解的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)從對照組7%上升至Dlg5敲減時30%～35%(P0.05),每個細(xì)胞相對降解區(qū)域從對照組1上升至5-6(P0.05);及促進(jìn)細(xì)胞侵襲能力提高(提高～2倍,P0.05)。(3)在SK-Hep1細(xì)胞,Dlg5過表達(dá)抑制間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA和Fibronectin表達(dá),部分恢復(fù)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá);同時抑制侵襲性偽足形成(含有侵襲性偽足的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)平均值:20%vs.5%,P0.05)、功能成熟(帶有明膠降解的細(xì)胞百分?jǐn)?shù):30%vs.5%,P0.05)、及細(xì)胞侵襲能力(下降～66%,P0.05),但未影響細(xì)胞生長。(4)在HepG2/shDlg5細(xì)胞,再敲減Tks5或Girdin抑制了 Dlg5敲減誘導(dǎo)的侵襲性偽足形成(含有侵襲性偽足的細(xì)胞百分?jǐn)?shù):與單獨敲減Dlg5相比,再敲減Tks5下降～90%,再敲減Girdin下降90%,P均0.05)及明膠降解功能成熟(帶有明膠降解的細(xì)胞百分?jǐn)?shù):與單獨敲減Dlg5相比,再敲減Tks5下降90%,再敲減Girdin下降90%,P均0.05),及侵襲能力(與單獨敲減Dlg5相比,再敲減Tks5下降～40%,再敲減Girdin下降90%,P均0.05)的提高,采用WT Tks5,而不是非磷酸化變異Tks5-Y530/592F挽救Tks5表達(dá)或采用WT Girdin挽救Girdin表達(dá)后Dlg5敲減引起的侵襲性偽足形成、明膠降解功能及細(xì)胞侵襲能力恢復(fù)。3、體外分子機(jī)制研究:(1)在HepG2細(xì)胞,免疫共沉淀顯示Dlg5可結(jié)合Girdin,反義亦然;但Dlg5未能共沉淀Tks5;對照組細(xì)胞Girdin與Tks5相互作用較少,Dlg5敲減后相同量的Girdin能共沉淀更多Tks5,反之亦然;挽救Dlg5表達(dá),Girdin與Tks5間相互沉淀又減弱。免疫熒光共聚焦顯微觀察到對照組細(xì)胞Girdin與Tks5共定位程度低,Dlg5敲減后Girdin與Tks5共定位在類似侵襲性偽足斑點狀結(jié)構(gòu)(Girdin與Tks5共定位Pearson相關(guān)系數(shù):對照組0.2 vs.Dlg5敲減組0.5～0.6,P0.05),挽救Dlg5表達(dá),Girdin與Tks5共定位程度下降(Girdin與Tks5共定位Pearson相關(guān)系數(shù):Dlg5敲減組0.6 vs.Dlg5挽救組0.2,P0.05)。(2)免疫沉淀顯示:在HepG2/shDlg5細(xì)胞較HepG2/shCtrl細(xì)胞,Girdin-pS1416、Girdin-pY1764、Tks5 酪氨酸磷酸化、FAK-pY397、及 Src-pY416增加;在HepG2/shDlg5細(xì)胞,再敲減Girdin,Dlg5敲減誘導(dǎo)的Girdin-pS1416、Girdin-pY1764、Tks5 酪氨酸磷酸化、FAK-pY397、及 Src-pY416 活化被抑制;在此基礎(chǔ)上挽救Girdin表達(dá),Dlg5敲減誘導(dǎo)的Girdin-pS1416、Girdin-pY1764、Tks5酪氨酸磷酸化、FAK-pY397、及Src-pY416活化恢復(fù)。在HepG2/shDlg5細(xì)胞,FAK及Src特異性抑制劑(PF-573228及SU-6656)處理造成Dlg5敲減誘導(dǎo)的Tks5酪氨酸磷酸化、FAK-pY397、及Src-pY416活化被抑制。(3)在HepG2細(xì)胞,TGF-βl處理72hDlg5下調(diào),呈濃度依賴性:外源性表達(dá)Dlg5幾乎廢除了 TGF-β1這種作用;同時TGF-β1處理促進(jìn)Girdin與Tks5相互結(jié)合,亦呈濃度依賴性,且該作用在外源性表達(dá)Dlg5時被廢除。]Ong/ml TGF-β1 處理 72h 增加了 Girdin-pS1416、Girdin-pY1764、Tks5 酪氨酸磷酸化、FAK-pY397、及Src-pY416活化,該作用在外源性表達(dá)Dlg5時被廢除。10ng/ml TGF-β1處理72h增加了 HepG2細(xì)胞侵襲性偽足形成(含有侵襲性偽足的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)5%vs.35%,P0.05)及功能(帶有明膠降解的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)5%vs.45%,P0.05),該作用在外源性表達(dá)Dlg5時被廢除。4、體內(nèi)研究:(1)microPET/CT顯示Dlg5過表達(dá)抑制了 SK-Hep1細(xì)胞原位移植瘤裸鼠模型肺內(nèi)18F-氟脫氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucose,18F-FDG)標(biāo)準(zhǔn)攝取率(Standard uptake value,SUV,對照組平均值1.8 vs.Dlg5過表達(dá)組0.7,P0.05)。(2)組織學(xué)檢測顯示Dlg5過表達(dá)抑制了 SK-Hep1細(xì)胞原位移植裸鼠模型肝、肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目(肝腫瘤結(jié)節(jié)個數(shù)的中位數(shù),對照組15 vs.Dlg5過表達(dá)組5,P0.05;肺腫瘤結(jié)節(jié)個數(shù)的中位數(shù),對照組4 vs.Dlg5過表達(dá)組1,P0.05)和大小(肝內(nèi)直徑0.5mm的腫瘤結(jié)節(jié)個數(shù)的中位數(shù),對照組9vs.Dlg5過表達(dá)組3,P0.05;肺內(nèi)直徑0.5mm的腫瘤結(jié)節(jié)個數(shù)的中位數(shù),對照組3vs.Dlg5過表達(dá)組0,P0.05)。[結(jié)論]我們的數(shù)據(jù)首次證明:1、Dlg5在HCC組織較癌旁標(biāo)本表達(dá)顯著降低,HCC組織中Dlg5表達(dá)水平降低與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移指標(biāo)及預(yù)后不良相關(guān);2、Dlg5下調(diào)可增強HCC細(xì)胞侵襲能力,至少部分通過促進(jìn)侵襲性偽足形成及基質(zhì)降解能力實現(xiàn)。3、Dlg5下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞侵襲性偽足形成的作用,至少部分依賴于涉及Girdin與Tks5的分子機(jī)制。4、Dlg5可抑制Girdin與Tks5相互結(jié)合,而這種結(jié)合有可能對Tks5磷酸化活化重要,從而促進(jìn)侵襲性偽足產(chǎn)生。5、TGF-β1可下調(diào)Dlg5表達(dá),故可作為Dlg5/Girdin/Tks5通路生理性調(diào)節(jié)因子,促進(jìn)侵襲性偽足形成及功能。6、過表達(dá)Dlg5可抑制SK-Hep1細(xì)胞裸鼠原位移植模型肝、肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目和大小。由于Dlg5下調(diào)同時促進(jìn)EMT,這些研究結(jié)果提供了一個新的模型,在此模型中一個分子(Dlg5)同時調(diào)控EMT和侵襲性偽足形成兩種細(xì)胞行為,從而促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲能力最優(yōu)化。該研究至少部分闡釋了肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,也為Dlg5作為肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、預(yù)后預(yù)測因子提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7
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本文編號：2003794