本文選題：腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 + FUT4LeY�。� 參考：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：一、背景非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是高發(fā)病率和死亡率的惡性腫瘤,約占肺癌所有病理類型的80~85%,以腺癌居多。盡管近年來NSCLC的診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展,但5年生存率僅13%左右。因此,深入研究NSCLC惡性演進(jìn)的分子機(jī)制對于改善其療效和預(yù)后至關(guān)重要。近年來大量研究表明腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是決定腫瘤惡性生物學(xué)行為的關(guān)鍵因素。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是指在腫瘤組織中浸潤的巨噬細(xì)胞,是TME中數(shù)量最多的間質(zhì)細(xì)胞群。多項研究表明TAMs參與了腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個過程,且其浸潤數(shù)量與包括NSCLC在內(nèi)的多種實體瘤的治療耐藥和不良預(yù)后密切相關(guān)。TAMs的促腫瘤作用與其呈巨噬細(xì)胞M2極化表型有關(guān)。然而,TAMs在肺腺癌中的確切作用仍不清楚。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細(xì)胞失去極性并獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的過程,是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力的重要步驟。大量研究表明,EMT與包括NSCLC在內(nèi)的多種實體瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。在口腔鱗癌、胰腺癌等腫瘤中的初步研究顯示TAMs能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT,但其在肺腺癌中的作用仍不清楚。異常的糖基化是腫瘤的標(biāo)志性特征之一。Lewis Y(Le Y)是一種雙巖藻糖基化的寡糖,巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶4(Fucosyltransferase IV,FUT4)是Le Y合成的關(guān)鍵酶。FUT4/Le Y在包括肺癌在內(nèi)的多種實體瘤中高表達(dá),并與侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)。然而,TAMs與FUT4/Le Y介導(dǎo)的巖藻糖基化的關(guān)系目前未見報道。泛素特異性肽酶22(ubiquitin-specific protease22,USP22)是一種新發(fā)現(xiàn)的去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)家族成員,具有使組蛋白H2A、H2B去泛素化、組蛋白H4乙�；墓δ�。USP22在多種實體瘤中高表達(dá),并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療耐藥和不良預(yù)后密切相關(guān)。然而,TAMs與USP22介導(dǎo)的去泛素化的關(guān)系目前未見報道。本研究旨在探討肺腺癌中FUT4/Le Y介導(dǎo)的巖藻糖基化在TAMs誘導(dǎo)的EMT中的作用,以及USP22介導(dǎo)的去泛素化在TAMs的趨化過程中的作用,有望為以TAMs為靶點的免疫治療提供新的理論依據(jù)。二、方法1、收集2015年1月~2015年6月于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科切除并于病理科存檔的肺腺癌石蠟組織標(biāo)本60例。利用免疫組化方法檢測CD68、E-cadherin、Le Y、USP22的表達(dá)。分析CD68、E-cadherin和Le Y表達(dá)的相關(guān)性,以及CD68和USP22表達(dá)的相關(guān)性。利用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,以P0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。表達(dá)率的組間差異比較采用χ2檢驗。2、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組的FUT4干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299細(xì)胞系中,通過G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FUT4干擾質(zhì)粒的細(xì)胞克隆。構(gòu)建Ezrin的野生型(wild-type,WT)過表達(dá)載體及T567D點突變過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染。同樣的方法在人肺腺癌細(xì)胞系H1299和H358細(xì)胞系中分別構(gòu)建穩(wěn)定干擾或過表達(dá)USP22的細(xì)胞系。3、ELISA方法檢測巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1的表達(dá),以及肺腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)上清中IL-1、IL-6、IL-8、CCL-2、CXCL1的表達(dá)。4、Western blot方法檢測FUT4、Le Y、EMT標(biāo)志蛋白、Ezrin、USP22、p65、H2B-ub1和IκB等蛋白的表達(dá)。5、間接免疫熒光方法檢測β-catenin、F-actin及E-Cadherin的表達(dá)。6、免疫共沉淀方法檢測Ezrin蛋白上Le Y糖蛋白的表達(dá),以及UEA凝集素識別的巖藻糖基化水平。7、染色質(zhì)免疫共沉淀方法檢測H2B-Ubi與p65靶基因的結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ(絲氨酸-5磷酸化位點)與p65靶基因的結(jié)合以及p65與靶基因的結(jié)合。8、裸鼠成瘤實驗證明肺腺癌中FUT4/Le Y對TAMs誘導(dǎo)的EMT的影響,以及USP22對TAMs浸潤的影響。三、結(jié)果(一)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過FUT4/Le Y介導(dǎo)的Ezrin磷酸化促進(jìn)肺腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究1、人類肺腺癌組織中E-cadherin和Le Y的表達(dá)水平與TAMs的數(shù)量顯著相關(guān)TAMs陰性組中E-cadherin的表達(dá)顯著高于TAMs陽性組(P0.01),Le Y的表達(dá)則顯著低于TAMs陽性組(P0.01)。TAMs的數(shù)量與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.505,P0.01),與Le Y的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.55,P0.01)。E-cadherin與Le Y的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.798,P0.01)。2、M2型巨噬細(xì)胞通過TGF-β1/smad信號通路促進(jìn)FUT4/Le Y的表達(dá)M2巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基(TAM conditioned medium,TCM)中TGF-β1的表達(dá)水平與正常培養(yǎng)基相比顯著上調(diào),且呈濃度依賴性。TCM能夠顯著上調(diào)FUT4/Le Y的表達(dá)及Smad2/3的磷酸化,且呈濃度依賴性。LY36494和SB431542阻斷TGF-β1/Smad信號通路后,TCM則無法上調(diào)FUT4/Le Y的表達(dá)。TGF-β1能夠顯著上調(diào)FUT4/Le Y的表達(dá),且呈濃度依賴性。3、FUT4/Le Y在M2型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重構(gòu)及EMT中必不可少A549和H1299細(xì)胞系中干擾FUT4后Le Y的表達(dá)也顯著下調(diào)。TCM處理后,A549和H1299細(xì)胞由鵝卵石樣的上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài),且間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和Fibronectin的表達(dá)顯著上調(diào)。在上述兩個細(xì)胞系中穩(wěn)定干擾FUT4后,TCM則無法使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,同時間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)也顯著低于僅用TCM處理組。聯(lián)用外源性Le Y抗體和FUT4-sh RNA處理A549和H1299細(xì)胞后,間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)較單用外源性Le Y抗體或FUT4sh RNA處理下調(diào)更為明顯。TCM誘導(dǎo)后,對照組A549細(xì)胞胞膜上E-cadherin顯著下調(diào),β-catenin由胞膜和胞漿移位至胞核,β-catenin的胞核表達(dá)顯著上調(diào)。在A549細(xì)胞中穩(wěn)定干擾FUT4后,E-cadherin的表達(dá)較單用TCM處理組顯著上調(diào),β-catenin則由核內(nèi)重新定位至胞膜和胞漿,且其核內(nèi)表達(dá)量較單用TCM處理組顯著下調(diào)。TCM處理后,A549細(xì)胞中的F-actin大量聚合,并延伸出偽足,而對照組的細(xì)胞骨架為網(wǎng)狀。在A549細(xì)胞中穩(wěn)定干擾的表達(dá)后,TCM處理則不能使F-actin發(fā)生上述形態(tài)改變。4、FUT4/Le Y介導(dǎo)的Ezrin巖藻糖基化與Ezrin磷酸化密切相關(guān)TCM能夠濃度依賴性地上調(diào)Ezrin蛋白T567位點磷酸化以及細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)。在A549和H1299細(xì)胞中穩(wěn)定干擾FUT4后,TCM則無法上調(diào)上述蛋白的表達(dá)。在TCM處理的同時給予衣霉素預(yù)處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ezrin的N-糖基化受抑制后,TCM無法有效誘導(dǎo)Ezrin發(fā)生磷酸化,同時N-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)也并未明顯上調(diào)。生物信息學(xué)預(yù)測(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net NGlyc/)提示Ezrin蛋白擁有585個氨基酸,其23-26(NTTG)及247-250(NISF)的氨基酸序列是兩個潛在的N-糖基化位點。免疫共沉淀方法證實Ezrin蛋白上存在Le Y糖蛋白的表達(dá)。應(yīng)用UEA凝集素對Ezrin的巖藻糖基化水平進(jìn)行檢測,免疫共沉淀結(jié)果顯示穩(wěn)定干擾FUT4后Ezrin的巖藻糖基化水平顯著下降。TCM處理條件下,過表達(dá)WT-Ezrin的載體能夠回補干擾FUT4所導(dǎo)致的Ezrin T567D位點磷酸化水平下調(diào)和間充質(zhì)標(biāo)志物下調(diào)。過表達(dá)T567D-Ezrin則未出現(xiàn)上述改變。5、動物實驗證實M2型巨噬細(xì)胞通過上調(diào)Le Y和p-Ezrin促進(jìn)肺腺癌發(fā)生EMT將M2或M0型巨噬細(xì)胞與A549細(xì)胞1:4預(yù)混后進(jìn)行裸鼠皮下種瘤。M2組于第6天成瘤,M0組直至11天成瘤。M2組的腫瘤體積顯著高于M0組(P0.01)。M2組E-cadherin的表達(dá)顯著低于M0組,同時伴有Vimentin的表達(dá)上調(diào)。此外,M2組中Le Y及p-Ezrin的表達(dá)顯著高于M0組。(二)USP22調(diào)控NF-κB通路促進(jìn)肺腺癌中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤的機(jī)制研究1、人類肺腺癌組織中USP22的表達(dá)與TAMs的浸潤密切相關(guān)USP22陽性組中TAMs的陽性率為84.2%(32/38),而USP22陰性組TAMs的陽性率為18.2%(4/22),具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。USP22的表達(dá)水平與TAMs的浸潤數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.649,P0.01)。2、USP22能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞中NF-κB靶基因的轉(zhuǎn)錄選取USP22表達(dá)水平最高的H1299細(xì)胞系構(gòu)建穩(wěn)定干擾USP22的細(xì)胞系,選取USP22表達(dá)水平最低的H358細(xì)胞系構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)USP22的細(xì)胞系。在10ng/ml TNF-α處理30min條件下,干擾USP22能夠顯著抑制H1299細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1、IL-6、IL-8、CCL-2、CXCL-1的表達(dá),過表達(dá)USP22則顯著上調(diào)H358細(xì)胞培養(yǎng)基中上述因子的表達(dá);未經(jīng)TNF-α處理組則未出現(xiàn)上述改變。在10ng/ml TNF-α處理30min條件下,干擾p65的表達(dá)能夠顯著抑制USP22過表達(dá)導(dǎo)致的上述因子表達(dá)上調(diào)。3、肺腺癌細(xì)胞中的USP22通過NF-κB通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤在TNF-α處理條件下,干擾H1299細(xì)胞系中USP22的表達(dá)能夠顯著抑制巨噬細(xì)胞的侵襲,過表達(dá)H358細(xì)胞系中USP22的表達(dá)能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的侵襲;而未經(jīng)TNF-α處理組則未出現(xiàn)上述改變。利用p65-si RNA在穩(wěn)定過表達(dá)USP22的H358細(xì)胞系中干擾p65的表達(dá)能夠顯著抑制USP22過表達(dá)對巨噬細(xì)胞浸潤的促進(jìn)作用。4、USP22通過去泛素化組蛋白H2B介導(dǎo)p65與其靶基因啟動子的結(jié)合無論是否給予TNF-α處理,USP22干擾或過表達(dá)均無法影響IκB及p65的核定位。TNF-α處理條件下,干擾USP22的表達(dá)能夠抑制H2B-Ubi與p65靶基因的結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ與p65靶基因的結(jié)合,以及p65與靶基因的結(jié)合。5、動物實驗證實肺腺癌中的USP22能夠促進(jìn)TAMs的浸潤將構(gòu)建的穩(wěn)定干擾USP22的USP22-sh1和sh-con H1299細(xì)胞接種至裸鼠皮下成瘤。USP22-sh1組的腫瘤體積(780±86 mm3)顯著低于USP22 sh-con組(2200±231 mm3)(P0.01)。免疫組化顯示USP-sh1組H2B-Ubi的表達(dá)顯著高于USP22-sh-con組,USP-sh1組鼠巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80的表達(dá)顯著低于USP22 sh-con組。組織勻漿中USP-sh1組IL-1、IL-6、CCL-2、CXCL1的表達(dá)水平均顯著低于USP22-sh-con組,而IL-8的表達(dá)并無差異。四、結(jié)論(一)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過FUT4/Le Y介導(dǎo)的Ezrin磷酸化促進(jìn)肺腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究1、人類肺腺癌組織中E-cadherin和Le Y的表達(dá)水平與TAMs的數(shù)量顯著相關(guān)。2、M2型巨噬細(xì)胞通過TGF-β1/smad信號通路促進(jìn)FUT4/Le Y的表達(dá)。3、FUT4/Le Y在M2型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重構(gòu)及EMT中必不可少。4、FUT4/Le Y介導(dǎo)的Ezrin巖藻糖基化與Ezrin磷酸化密切相關(guān)。5、動物實驗證實M2型巨噬細(xì)胞通過上調(diào)Le Y和p-Ezrin促進(jìn)肺腺癌發(fā)生EMT。(二)USP22調(diào)控NF-κB通路促進(jìn)肺腺癌中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤的機(jī)制研究1、人類肺腺癌組織中USP22的表達(dá)與TAMs的浸潤密切相關(guān)。2、USP22能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞中NF-κB靶基因的轉(zhuǎn)錄。3、肺腺癌細(xì)胞中的USP22通過NF-κB通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤。4、USP22通過去泛素化組蛋白H2B介導(dǎo)p65與其靶基因啟動子的結(jié)合。5、動物實驗證實肺腺癌中的USP22能夠促進(jìn)TAMs的浸潤。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊晉平,王澤,張?zhí)K;肺腺癌5-羥色胺受體的免疫組織化學(xué)定位[J];四川解剖學(xué)雜志;2003年02期

2 吳一龍,林嘉穎,楊學(xué)寧,喬貴賓,王坤,陳剛;肺腺癌患者酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)通路的異常與臨床預(yù)后[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年12期

3 張利群,陳杭薇,王四海,辛慶紅,杜玉國,尤蘭華;人呼吸道合胞病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞系的研究[J];山東醫(yī)藥;2005年12期

4 黎聯(lián);梅同華;周向東;張新高;車德亞;;細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路與基質(zhì)金屬蛋白酶-26在肺腺癌表達(dá)中的關(guān)系[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2009年02期

5 王亞南;顧國浩;;生物芯片在肺腺癌研究和診療中的應(yīng)用進(jìn)展[J];國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2011年02期

6 ;我國人體肺腺癌細(xì)胞系建立[J];腫瘤;1981年06期

7 季晨陽,張義R，

本文編號：2000644