本文選題：miR-20a + 破骨細胞分化　； 參考：《山東大學》2017年博士論文

【摘要】：背景和目的牙周病是由多種革蘭氏陰性菌引起感染性疾病。牙齦卟啉單胞菌是牙周病主要致病菌。脂多糖是牙齦卟啉單胞菌主要毒力因子,對宿主細胞具有破壞作用。因此,細菌感染可引起牙周組織的炎癥反應,進而引起牙槽骨的破壞和牙齒脫落。牙周病導致的牙槽骨吸收過程受破骨細胞調控。破骨細胞來源于造血干細胞的單核/巨噬細胞系統(tǒng)。THP-1細胞可分化成成熟的巨噬細胞,進而誘導分化成為破骨細胞。許多細胞因子可以正性或負性調節(jié)破骨細胞增殖、存活、分化和功能。M-CSF和RANKL可由成骨細胞或活化的T細胞產生,是調控破骨細胞重要的細胞因子。RANKL可以誘導活化T細胞核因子1(NF/TTc1)的表達�；罨疶細胞核因子1可以和破骨細胞相關基因如如抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和組織蛋白酶K等結合,參與破骨細胞分化和成熟。MicroRNAs(miRNAs)是一段由19-22個核苷酸組成的非編碼的小分子RNA,對基因轉錄后水平進行調控。microRNAs主要參與調控成骨細胞,破骨細胞以及骨細胞的分化、增殖以及功能,從而參與胚胎期骨質發(fā)育和成年骨組織功能的保持。MiR-20a是miR-17-92基因簇的典型代表,miR-17-92基因簇是研究較為廣泛的家族之一。文獻報道,miR-17-92基因簇在單核細胞分化和成熟中具有關鍵作用。MiR-17-92基因簇不僅參與骨骼形成過程,而且在保持骨骼功能正常方面具有重要作用。研究表明,許多miRNAs都參與成骨細胞分化、增殖以及形成過程。研究證實,miR-20a可以負性調節(jié)BMP信號通路的抑制劑如Bambi和Crim1的表達水平。進一步的研究還發(fā)現,miR-20a可以上調BMP2,BMP4,Runx2,OSX/Sp7,Ocn和Opn的表達,從而促進骨形成。近年來,miRNAs在破骨細胞方面的作用受到普遍關注。但是miR-20a對破骨細胞的功能和分化的研究還未見報道。MiR-20a可在多種組織和細胞內高度表達。它通過靶向不同基因,從而調控腫瘤,免疫疾病的發(fā)生,骨骼肌肉細胞等的分化,抑制內皮細胞的遷移,受損血管的修復。PPARγ是miR-20a調控一個重要的靶向基因。文獻表明,miR-20a表達上調可以導致小鼠表達成脂的PPARγ基因的蛋白水平水平升高。在骨組織的代謝中,miR-20a可以靶向PPARγ基因對成骨細胞分化起到調控作用。抑癌基因PTEN位于染色體10q23區(qū)域。在乳腺癌,卵巢癌,肝癌,腸癌中,PTEN也是miR-20a調控一個重要的靶向基因。近年研究已經證實,PTEN在調控細胞一系列活動如增殖,粘附,遷移,入侵,細胞凋亡等信號通路中發(fā)揮著重要的作用。本實驗分三部分進行,首先檢測miR-20a對THP-1細胞生物學性能的影響其中包括轉染實驗、細胞周期實驗、細胞凋亡實驗和細胞增殖實驗。其次探討miR-20a對破骨細胞分化的影響,最后檢測在LPS作用下,miR-20a對破骨細胞分化的影響,通過RT-PCR和WesternBlot檢測TRAP、NFATc1表達以及靶基因PPARγ,PTEN分子水平和蛋白水平表達情況,方法1.miR-20a對THP-1細胞增殖、周期和凋亡的影響人THP-1細胞在加入含10%FBS的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),細胞培養(yǎng)至較高密度時,向6孔板各孔加入PMA,使各孔終濃度為1Ong/ml。72h后,細胞貼壁,用PBS輕輕漂洗3次。實驗分5組,空白對照組,MimicsNC組,miR-20a mimics組,Inhibitor NC組,miR-20a inhibitor組。根據轉染效率評價的結果,轉染試劑Libofectamin2000,用于轉染各oligo,于轉染24h后,收取細胞,用于RT-PCR檢測。將上述轉染的5組(空白對照組,MimicsNC組,miR-20a mimics組,Inhibitor NC組,miR-20a inhibitor組)細胞種入96孔板中,避光加入CCK-8試劑,酶標儀450nm波長測其OD值,得到數據。細胞轉染至48h后,PBS洗細胞,加入細胞70%乙醇固定至少12小時,再次PBS洗細胞,加入1mLPI工作液室溫避光染色30分鐘。通過FSC/SSC散點圖收集細胞,利用Flowjo軟件處理。細胞轉染至48h后,離心收集細胞,微量離心機轉速1000RPM,離心時間5min,棄培養(yǎng)基。用冷PBS洗滌細胞兩次(2000RPM,離心時間5min收集細胞)。用400ul的Binding Buffer重懸細胞。在細胞懸液中避光加入5ul AnnexinV-FITC染液,4℃反應15min。反應后再避光加入10ul的PI混勻,4℃反應5min。在1小時內用流式細胞儀檢測。2.轉染miR-20a,檢測破骨細胞分化中TRAP,NFATc1,PPARγ,PTEN基因表達THP-1細胞在10cmdish中培養(yǎng)至較高密度時,再加入含10%FBS的1640培養(yǎng)液,向6孔板各孔加入PMA,使各孔終濃度分別為200ng/ml。3天后,根據轉染效率評價的結果,轉染試劑Lipofectamin2000,用于轉染各oligo。實驗分三組,空白對照組,MimicsNC組,Mimic-20a組。6h后換液,并加入M-CSF和sRANK Ligand繼續(xù)培養(yǎng),并使各孔兩種藥物的終濃度分別為25ng/ml、30ng/ml。在加入M-CSF和sRANK Ligand后72h,收取一套復孔進行TRAP染色與計數,一套復孔收取Western樣品,一套復孔收取RT-PCR樣品。3.轉染miR-20a,檢測在LPS作用下,破骨細胞分化中TRAP,NFATc1,PPARy,PTEN基因表達THP-1細胞在10cmdish中培養(yǎng)至較高密度時,加入含10%FBS的1640培養(yǎng)液,吹打使細胞形成單細胞懸液。向6孔板各孔加入PMA,使各孔終濃度分別為200ng/ml。3天后,根據轉染效率評價的結果,轉染試劑Lipofectamin2000,用于轉染各oligo。實驗分三組,空白對照組,MimicsNC組,Mimic-20a組。6h后換液,并加入M-CSF和sRANK Ligand繼續(xù)培養(yǎng),并使各孔兩種藥物的終濃度分別為25ng/ml、30ng/ml。在加入M-CSF和sRANK Ligand后72h,在三組中加入PG-LPS,使得用藥終濃度為1ug/ml,于PG-LPS加藥24h收取細胞樣品,一套復孔進行TRAP染色與計數,一套復孔收取Western樣品,一套復孔收取RT-PCR 樣品。結果1、miR-20a對THP-1細胞增殖、周期和凋亡的影響實驗中,我們使用CCK8法檢測miR-20a對THP-1細胞增殖的影響。結果證實,與空白對照組相比,miR-20a過表達和miR-20a抑制劑均抑制了THP-1細胞的增殖。但是對THP-1細胞的抑制作用在轉染后的第三天最為顯著。我們檢測miR-20a轉染THP-1細胞48h后,對THP-1細胞的細胞周期和細胞凋亡的影響。結果顯示,miR-20a過表達組與空白對照組相比,細胞周期中S期的不同具有統(tǒng)計學意義。然而miR-20a抑制組與空白對照組相比,不同在于G1期和S期。我們推論,miR-20a通過延長G1期,縮短了S期,阻滯了G1/S期時相轉換,抑制了 THP-1細胞的生長和增殖。進而我們使用流式細胞儀驗證miR-20a對THP-1細胞增殖的抑制作用是否是由于MiR-20a促進了THP-1細胞凋亡所致。結果顯示,和空白對照組相比,miR-20a轉染48h后,miR-20a過表達抑制了早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞,促進了活細胞的增殖。然而miR-20a抑制劑呈現出促進細胞凋亡的趨勢。因此,我們得出結論,miR-20a對于THP-1細胞增殖的抑制不是由于抑制細胞凋亡所致,miR-20a對于細胞增殖和細胞凋亡的影響是來源于不同的兩個信號通路。2、轉染miR-20a,檢測破骨細胞分化中TRAP,NFATc1,PPARγ,PTEN基因表達為了證實miR-20a在破骨細胞分化過程中的作用,我們先使用PMA處理THP-1細胞分化為巨噬細胞,再將miR-20a轉染至貼壁的巨噬細胞中,在M-CSF和RANKL誘導劑的誘導下繼續(xù)培養(yǎng)3天,應用熒光實時定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測破骨細胞相關基因TRAP和NFATc1的表達情況。TRAP和NFATc1是破骨細胞分化中具有關鍵作用的轉錄因子,研究顯示,與空白對照組和NC對照相比,miR-20a過表達組,TRAP和NFATC1的mRNA水平和蛋白水平明顯下降,提示在M-CSF和RANKL誘導的破骨細胞分化中,miR-20a起到抑制的作用。本實驗選擇PPARy作為miR-20a預測的靶基因。為了證實PPARy是否是miR-20a靶向目的基因,我們使用熒光實時定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測了在M-CSF和RANKL誘導破骨細胞分化過程中,miR-20a過表達情況下,PPARy的分子水平和蛋白水平的表達情況。實驗結果顯示,與空白對照組和NC對照組相比,在RANKL誘導破骨細胞分化過程中,miR-20a下調了 PPARγ基因的mRNA水平和蛋白水平。熒光實時定量PCR和蛋白免疫印跡檢測結果發(fā)現,與空白對照組和NC對照組相比,在RANKL誘導破骨細胞分化過程中,miR-20a下調了PTENmRNA水平。但是,我們并沒有檢測到PTEN蛋白水平的變化。因此,我們推測,PPARγ是miR-20a在RANKL誘導THP-1破骨細胞分化中的靶向基因。3.轉染miR-20a,檢測在LPS作用下,破骨細胞分化中TRAP,NFATc1,PPARγ,PTEN基因表達我們首先使用PMA處理THP-1細胞72h,再將miR-20a轉染至貼壁的THP-1細胞中,加入M-CSF和RANKL誘導劑,繼續(xù)誘導培養(yǎng)3天,加入LPS,24h后應用熒光實時定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測破骨細胞相關基因TRAP和NFATC1的表達情況。TRAP和NFATc1是破骨細胞分化中起關鍵作用的轉錄因子,我們研究證實,與空白對照組和NC對照相比,miR-20a過表達組,TRAP,NFATc1的mRNA水平明顯升高。我們結果表明,在LPS作用下,miR-20a對RANKL誘導破骨細胞起到促進的作用。本實驗采用人THP-1細胞,在PMA誘導貼壁,轉入miR-20a-Mimic和NC-FAM,在M-CSF和RANKL誘導THP-1細胞破骨分化72h,加入LPS刺激24h,采用熒光實時定量PCR和蛋白免疫印跡法,檢測PPARy和PTEN的分子水平和蛋白水平。熒光實時定量PCR結果顯示,與空白對照組和NC對照組相比,在M-CSF和RANKL誘導下,PTENmRNA水平和PPARymRNA明顯升高。蛋白免疫印跡法檢測PTEN和PPARγ蛋白水平,實驗發(fā)現,相比于空白對照組,在LPS作用下,PPARy蛋白水平明顯升高,但是PTEN的蛋白水平與空白對照組相比沒有變化。因此,我們推測,在LPS作用下,PPARy仍然是miR-20a的靶向基因,PPARy的上調促進了 THP-1破骨細胞的分化和成熟。結論1、miR-20a抑制細胞增殖,阻滯G1/S時相的轉換,對細胞凋亡呈現抑制作用。2、miR-20a對破骨細胞分化具有抑制作用,靶向PPARy基因。3、在LPS作用下,miR-20a對破骨細胞分化具有促進作用,靶向PPARγ基因
[Abstract]:In recent years , the role of miR - 17 - 92 gene cluster in the differentiation , survival , differentiation and function of bone - breaking cells has been studied . The effect of miR - 20a on cell differentiation was investigated by RT - PCR and Western Blot . After transfection , the cells were washed with PBS . After transfection , the cells were harvested at room temperature for 30 minutes . After transfection , the cells were harvested by centrifugation at 1000 RPM for 5 min , and the cells were washed twice with cold PBS ( 2000RPM , centrifugation time 5min to collect cells ) . The expression of TRAP , NFATc1 , PPARy and PTEN in cell suspension was incubated at 4 鈩，

本文編號：1962954