本文選題：miR-20a + 破骨細(xì)胞分化��； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景和目的牙周病是由多種革蘭氏陰性菌引起感染性疾病。牙齦卟啉單胞菌是牙周病主要致病菌。脂多糖是牙齦卟啉單胞菌主要毒力因子,對(duì)宿主細(xì)胞具有破壞作用。因此,細(xì)菌感染可引起牙周組織的炎癥反應(yīng),進(jìn)而引起牙槽骨的破壞和牙齒脫落。牙周病導(dǎo)致的牙槽骨吸收過程受破骨細(xì)胞調(diào)控。破骨細(xì)胞來源于造血干細(xì)胞的單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)。THP-1細(xì)胞可分化成成熟的巨噬細(xì)胞,進(jìn)而誘導(dǎo)分化成為破骨細(xì)胞。許多細(xì)胞因子可以正性或負(fù)性調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞增殖、存活、分化和功能。M-CSF和RANKL可由成骨細(xì)胞或活化的T細(xì)胞產(chǎn)生,是調(diào)控破骨細(xì)胞重要的細(xì)胞因子。RANKL可以誘導(dǎo)活化T細(xì)胞核因子1(NF/TTc1)的表達(dá)。活化T細(xì)胞核因子1可以和破骨細(xì)胞相關(guān)基因如如抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和組織蛋白酶K等結(jié)合,參與破骨細(xì)胞分化和成熟。MicroRNAs(miRNAs)是一段由19-22個(gè)核苷酸組成的非編碼的小分子RNA,對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控。microRNAs主要參與調(diào)控成骨細(xì)胞,破骨細(xì)胞以及骨細(xì)胞的分化、增殖以及功能,從而參與胚胎期骨質(zhì)發(fā)育和成年骨組織功能的保持。MiR-20a是miR-17-92基因簇的典型代表,miR-17-92基因簇是研究較為廣泛的家族之一。文獻(xiàn)報(bào)道,miR-17-92基因簇在單核細(xì)胞分化和成熟中具有關(guān)鍵作用。MiR-17-92基因簇不僅參與骨骼形成過程,而且在保持骨骼功能正常方面具有重要作用。研究表明,許多miRNAs都參與成骨細(xì)胞分化、增殖以及形成過程。研究證實(shí),miR-20a可以負(fù)性調(diào)節(jié)BMP信號(hào)通路的抑制劑如Bambi和Crim1的表達(dá)水平。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn),miR-20a可以上調(diào)BMP2,BMP4,Runx2,OSX/Sp7,Ocn和Opn的表達(dá),從而促進(jìn)骨形成。近年來,miRNAs在破骨細(xì)胞方面的作用受到普遍關(guān)注。但是miR-20a對(duì)破骨細(xì)胞的功能和分化的研究還未見報(bào)道。MiR-20a可在多種組織和細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)。它通過靶向不同基因,從而調(diào)控腫瘤,免疫疾病的發(fā)生,骨骼肌肉細(xì)胞等的分化,抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,受損血管的修復(fù)。PPARγ是miR-20a調(diào)控一個(gè)重要的靶向基因。文獻(xiàn)表明,miR-20a表達(dá)上調(diào)可以導(dǎo)致小鼠表達(dá)成脂的PPARγ基因的蛋白水平水平升高。在骨組織的代謝中,miR-20a可以靶向PPARγ基因?qū)Τ晒羌?xì)胞分化起到調(diào)控作用。抑癌基因PTEN位于染色體10q23區(qū)域。在乳腺癌,卵巢癌,肝癌,腸癌中,PTEN也是miR-20a調(diào)控一個(gè)重要的靶向基因。近年研究已經(jīng)證實(shí),PTEN在調(diào)控細(xì)胞一系列活動(dòng)如增殖,粘附,遷移,入侵,細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路中發(fā)揮著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)分三部分進(jìn)行,首先檢測(cè)miR-20a對(duì)THP-1細(xì)胞生物學(xué)性能的影響其中包括轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。其次探討miR-20a對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響,最后檢測(cè)在LPS作用下,miR-20a對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響,通過RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)TRAP、NFATc1表達(dá)以及靶基因PPARγ,PTEN分子水平和蛋白水平表達(dá)情況,方法1.miR-20a對(duì)THP-1細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響人THP-1細(xì)胞在加入含10%FBS的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)至較高密度時(shí),向6孔板各孔加入PMA,使各孔終濃度為1Ong/ml。72h后,細(xì)胞貼壁,用PBS輕輕漂洗3次。實(shí)驗(yàn)分5組,空白對(duì)照組,MimicsNC組,miR-20a mimics組,Inhibitor NC組,miR-20a inhibitor組。根據(jù)轉(zhuǎn)染效率評(píng)價(jià)的結(jié)果,轉(zhuǎn)染試劑Libofectamin2000,用于轉(zhuǎn)染各oligo,于轉(zhuǎn)染24h后,收取細(xì)胞,用于RT-PCR檢測(cè)。將上述轉(zhuǎn)染的5組(空白對(duì)照組,MimicsNC組,miR-20a mimics組,Inhibitor NC組,miR-20a inhibitor組)細(xì)胞種入96孔板中,避光加入CCK-8試劑,酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)其OD值,得到數(shù)據(jù)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染至48h后,PBS洗細(xì)胞,加入細(xì)胞70%乙醇固定至少12小時(shí),再次PBS洗細(xì)胞,加入1mLPI工作液室溫避光染色30分鐘。通過FSC/SSC散點(diǎn)圖收集細(xì)胞,利用Flowjo軟件處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染至48h后,離心收集細(xì)胞,微量離心機(jī)轉(zhuǎn)速1000RPM,離心時(shí)間5min,棄培養(yǎng)基。用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次(2000RPM,離心時(shí)間5min收集細(xì)胞)。用400ul的Binding Buffer重懸細(xì)胞。在細(xì)胞懸液中避光加入5ul AnnexinV-FITC染液,4℃反應(yīng)15min。反應(yīng)后再避光加入10ul的PI混勻,4℃反應(yīng)5min。在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。2.轉(zhuǎn)染miR-20a,檢測(cè)破骨細(xì)胞分化中TRAP,NFATc1,PPARγ,PTEN基因表達(dá)THP-1細(xì)胞在10cmdish中培養(yǎng)至較高密度時(shí),再加入含10%FBS的1640培養(yǎng)液,向6孔板各孔加入PMA,使各孔終濃度分別為200ng/ml。3天后,根據(jù)轉(zhuǎn)染效率評(píng)價(jià)的結(jié)果,轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin2000,用于轉(zhuǎn)染各oligo。實(shí)驗(yàn)分三組,空白對(duì)照組,MimicsNC組,Mimic-20a組。6h后換液,并加入M-CSF和sRANK Ligand繼續(xù)培養(yǎng),并使各孔兩種藥物的終濃度分別為25ng/ml、30ng/ml。在加入M-CSF和sRANK Ligand后72h,收取一套復(fù)孔進(jìn)行TRAP染色與計(jì)數(shù),一套復(fù)孔收取Western樣品,一套復(fù)孔收取RT-PCR樣品。3.轉(zhuǎn)染miR-20a,檢測(cè)在LPS作用下,破骨細(xì)胞分化中TRAP,NFATc1,PPARy,PTEN基因表達(dá)THP-1細(xì)胞在10cmdish中培養(yǎng)至較高密度時(shí),加入含10%FBS的1640培養(yǎng)液,吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。向6孔板各孔加入PMA,使各孔終濃度分別為200ng/ml。3天后,根據(jù)轉(zhuǎn)染效率評(píng)價(jià)的結(jié)果,轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin2000,用于轉(zhuǎn)染各oligo。實(shí)驗(yàn)分三組,空白對(duì)照組,MimicsNC組,Mimic-20a組。6h后換液,并加入M-CSF和sRANK Ligand繼續(xù)培養(yǎng),并使各孔兩種藥物的終濃度分別為25ng/ml、30ng/ml。在加入M-CSF和sRANK Ligand后72h,在三組中加入PG-LPS,使得用藥終濃度為1ug/ml,于PG-LPS加藥24h收取細(xì)胞樣品,一套復(fù)孔進(jìn)行TRAP染色與計(jì)數(shù),一套復(fù)孔收取Western樣品,一套復(fù)孔收取RT-PCR 樣品。結(jié)果1、miR-20a對(duì)THP-1細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響實(shí)驗(yàn)中,我們使用CCK8法檢測(cè)miR-20a對(duì)THP-1細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果證實(shí),與空白對(duì)照組相比,miR-20a過表達(dá)和miR-20a抑制劑均抑制了THP-1細(xì)胞的增殖。但是對(duì)THP-1細(xì)胞的抑制作用在轉(zhuǎn)染后的第三天最為顯著。我們檢測(cè)miR-20a轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞48h后,對(duì)THP-1細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,miR-20a過表達(dá)組與空白對(duì)照組相比,細(xì)胞周期中S期的不同具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而miR-20a抑制組與空白對(duì)照組相比,不同在于G1期和S期。我們推論,miR-20a通過延長(zhǎng)G1期,縮短了S期,阻滯了G1/S期時(shí)相轉(zhuǎn)換,抑制了 THP-1細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。進(jìn)而我們使用流式細(xì)胞儀驗(yàn)證miR-20a對(duì)THP-1細(xì)胞增殖的抑制作用是否是由于MiR-20a促進(jìn)了THP-1細(xì)胞凋亡所致。結(jié)果顯示,和空白對(duì)照組相比,miR-20a轉(zhuǎn)染48h后,miR-20a過表達(dá)抑制了早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞,促進(jìn)了活細(xì)胞的增殖。然而miR-20a抑制劑呈現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)。因此,我們得出結(jié)論,miR-20a對(duì)于THP-1細(xì)胞增殖的抑制不是由于抑制細(xì)胞凋亡所致,miR-20a對(duì)于細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響是來源于不同的兩個(gè)信號(hào)通路。2、轉(zhuǎn)染miR-20a,檢測(cè)破骨細(xì)胞分化中TRAP,NFATc1,PPARγ,PTEN基因表達(dá)為了證實(shí)miR-20a在破骨細(xì)胞分化過程中的作用,我們先使用PMA處理THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞,再將miR-20a轉(zhuǎn)染至貼壁的巨噬細(xì)胞中,在M-CSF和RANKL誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下繼續(xù)培養(yǎng)3天,應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)破骨細(xì)胞相關(guān)基因TRAP和NFATc1的表達(dá)情況。TRAP和NFATc1是破骨細(xì)胞分化中具有關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子,研究顯示,與空白對(duì)照組和NC對(duì)照相比,miR-20a過表達(dá)組,TRAP和NFATC1的mRNA水平和蛋白水平明顯下降,提示在M-CSF和RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中,miR-20a起到抑制的作用。本實(shí)驗(yàn)選擇PPARy作為miR-20a預(yù)測(cè)的靶基因。為了證實(shí)PPARy是否是miR-20a靶向目的基因,我們使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)了在M-CSF和RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過程中,miR-20a過表達(dá)情況下,PPARy的分子水平和蛋白水平的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組和NC對(duì)照組相比,在RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過程中,miR-20a下調(diào)了 PPARγ基因的mRNA水平和蛋白水平。熒光實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組和NC對(duì)照組相比,在RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過程中,miR-20a下調(diào)了PTENmRNA水平。但是,我們并沒有檢測(cè)到PTEN蛋白水平的變化。因此,我們推測(cè),PPARγ是miR-20a在RANKL誘導(dǎo)THP-1破骨細(xì)胞分化中的靶向基因。3.轉(zhuǎn)染miR-20a,檢測(cè)在LPS作用下,破骨細(xì)胞分化中TRAP,NFATc1,PPARγ,PTEN基因表達(dá)我們首先使用PMA處理THP-1細(xì)胞72h,再將miR-20a轉(zhuǎn)染至貼壁的THP-1細(xì)胞中,加入M-CSF和RANKL誘導(dǎo)劑,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3天,加入LPS,24h后應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)破骨細(xì)胞相關(guān)基因TRAP和NFATC1的表達(dá)情況。TRAP和NFATc1是破骨細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子,我們研究證實(shí),與空白對(duì)照組和NC對(duì)照相比,miR-20a過表達(dá)組,TRAP,NFATc1的mRNA水平明顯升高。我們結(jié)果表明,在LPS作用下,miR-20a對(duì)RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞起到促進(jìn)的作用。本實(shí)驗(yàn)采用人THP-1細(xì)胞,在PMA誘導(dǎo)貼壁,轉(zhuǎn)入miR-20a-Mimic和NC-FAM,在M-CSF和RANKL誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞破骨分化72h,加入LPS刺激24h,采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡法,檢測(cè)PPARy和PTEN的分子水平和蛋白水平。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組和NC對(duì)照組相比,在M-CSF和RANKL誘導(dǎo)下,PTENmRNA水平和PPARymRNA明顯升高。蛋白免疫印跡法檢測(cè)PTEN和PPARγ蛋白水平,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),相比于空白對(duì)照組,在LPS作用下,PPARy蛋白水平明顯升高,但是PTEN的蛋白水平與空白對(duì)照組相比沒有變化。因此,我們推測(cè),在LPS作用下,PPARy仍然是miR-20a的靶向基因,PPARy的上調(diào)促進(jìn)了 THP-1破骨細(xì)胞的分化和成熟。結(jié)論1、miR-20a抑制細(xì)胞增殖,阻滯G1/S時(shí)相的轉(zhuǎn)換,對(duì)細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)抑制作用。2、miR-20a對(duì)破骨細(xì)胞分化具有抑制作用,靶向PPARy基因。3、在LPS作用下,miR-20a對(duì)破骨細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用,靶向PPARγ基因
[Abstract]:In recent years , the role of miR - 17 - 92 gene cluster in the differentiation , survival , differentiation and function of bone - breaking cells has been studied . The effect of miR - 20a on cell differentiation was investigated by RT - PCR and Western Blot . After transfection , the cells were washed with PBS . After transfection , the cells were harvested at room temperature for 30 minutes . After transfection , the cells were harvested by centrifugation at 1000 RPM for 5 min , and the cells were washed twice with cold PBS ( 2000RPM , centrifugation time 5min to collect cells ) . The expression of TRAP , NFATc1 , PPARy and PTEN in cell suspension was incubated at 4 鈩，

本文編號(hào)：1962954