本文選題：卵巢透明細胞癌 + 賴氨酰氧化酶�。� 參考：《山東大學》2017年博士論文

【摘要】：研究背景:卵巢癌是婦科常見的生殖道惡性腫瘤,死亡率居婦科腫瘤之首,嚴重威脅了廣大女性的健康和生命。疾病的早期診斷困難以及復發(fā)、轉移所致的治療手段缺乏,是卵巢癌死亡率居高不下的主要原因。卵巢透明細胞腫瘤是上皮性卵巢腫瘤中的一種,絕大部分為惡性腫瘤,約占卵巢上皮性癌的5%,在東方女性中較西方更為常見。卵巢透明細胞癌雖較少見,但因具有對化療不敏感、易耐藥、早期復發(fā)、預后差的特點,引起了婦科腫瘤研究者的廣泛關注。賴氨酰氧化酶(Lysyl oxidase,LOX)是細胞外基質(extracellular matrix,ECM)中催化膠原與彈性蛋白聚合的關鍵酶。研究表明LOX可調節(jié)細胞移動,參與基因調節(jié)、細胞分化、生長調控及促使正常細胞發(fā)生惡性轉化等。近期研究發(fā)現腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,細胞的分化、生長控制、黏附性、活性、惡性轉化及侵襲性等均與細胞外基質中LOX的異常表達密切相關。目前認為LOX可能具有雙重作用,既是腫瘤抑制因子,同時也很可能是腫瘤轉移的促進因子。之前很多文獻報道LOX在不同類型的腫瘤細胞系和原發(fā)性腫瘤中的表達出現紊亂,令人感興趣的是,LOX在不同類型腫瘤中表達改變也不相同,在病理狀態(tài)下LOX的表達出現上調或下調的情況均有報道。然而,LOX在卵巢癌中,尤其是卵巢透明細胞癌中的表達及生物學功能仍不明確。microRNA是一類內源性、非編碼、單鏈小分子RNA,通過促進靶基因mRNA降解和(或)抑制其翻譯,在轉錄后水平發(fā)揮調控基因表達的作用。microRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關,其異常表達導致腫瘤細胞無限增殖、凋亡抑制,并促進腫瘤的侵襲、轉移,同時也是腫瘤細胞間質重塑和腫瘤血管生成的重要因素。研究表明microRNA具有很好的組織特異性,并且其表達在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段也具有差異性,這提示我們可以使用microRNA作為腫瘤早期診斷及病情監(jiān)測的標志物。近年來,關于卵巢癌中microRNA功能的研究越來越多。結論表明,多種microRNA參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。有些是作為原癌基因發(fā)揮促進腫瘤細胞增殖、侵襲以及轉移的作用,而有些則作為抑癌基因發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。通過生物信息學預測,我們發(fā)現miR-29b可能是能夠轉錄后調控LOX的microRNA�，F有研究表明,miR-29b的表達在乳腺癌,肝癌,前列腺癌等多種腫瘤中均呈不同程度下調,并且參與了結腸腺瘤向結腸癌發(fā)展的早期過程,提示miR-29b在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能作為抑癌因子發(fā)揮作用。另有研究發(fā)現,miR-29家族與細胞凋亡關系密切,通過誘導細胞凋亡促進乳腺癌和結腸癌的發(fā)生、發(fā)展,也可在膽管癌細胞中通過抑制Mcl-1的表達增加細胞對TRAIL的凋亡敏感性,從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。目前miR-29的研究已涉及多種腫瘤,microRNA表達譜顯示,miR-29在卵巢癌中失調表達,但其發(fā)揮生物學功能的具體分子生物學機制仍不清楚。綜上所述,研究LOX在卵巢透明細胞癌中的功能,篩選出在卵巢透明細胞癌中能夠將LOX作為靶基因的microRNA,并探究其發(fā)揮生物學功能的機制,將為LOX有可能成為卵巢透明細胞癌治療和預防轉移的新靶點提供理論基礎。研究目的:(1)檢測卵巢透明細胞癌組織、癌旁組織以及多種卵巢癌的細胞系中LOX的表達。(2)檢測過表達LOX對卵巢透明細胞癌細胞增殖能力和侵襲能力的影響,確定LOX的生物學功能。(3)篩選并證實在卵巢透明細胞癌中能夠調控LOX的microRNA,并分析其與LOX表達量之間的關系。(4)檢測miR-29b異常表達對卵巢透明細胞癌細胞增殖能力和侵襲能力的影響。研究方法:1.收集27例外科切除手術所得的卵巢透明細胞癌組織及癌旁組織標本,使用免疫組化法對癌組織標本及癌旁組織標本中LOX的蛋白表達水平進行檢測,統(tǒng)計分析不同組織中LOX的陽性表達率,進行分析。此外,體外培養(yǎng)多種卵巢癌細胞系,例如人卵巢透明細胞癌細胞ES-2,人卵巢上皮細胞癌細胞OV-1063,人卵巢腺癌細胞SKOV3和人卵巢腺癌細胞OVCAR-3,以正常卵巢上皮細胞為陰性對照,使用Western blot法檢測細胞中LOX的蛋白表達水平。2.將LOX的編碼區(qū)構建到pcDNA3骨架質粒上,建立pcDNA3-LOX過表達質粒,并將該過表達質粒轉染至ES-2細胞中,用Western blot法驗證過表達效率。瞬時轉染LOX過表達質粒24小時(24 h)、48小時(48 h)和72小時(72h)后,使用CCK-8法檢測過表達LOX對細胞增殖能力的影響。瞬時轉染LOX過表達質粒48 h后,使用Transwell法檢測過表達LOX對細胞侵襲能力的影響。3.通過生物信息學網站Targetscan尋找并篩選可能的microRNA。使用實時定量PCR法對ES-2,OV-1063,SKOV3和OVCAR-3幾種卵巢癌細胞中miR-29b的表達譜進行檢測,并與LOX的表達譜進行比較,進一步明確miR-29b與LOX表達之間的關系。將LOX基因m RNA 3'UTR區(qū)構建到pMIR-REPORTTM質粒上形成Luc-LOX3'UTRWT質粒,進行熒光素酶報告實驗,并將Luc-LOX3'UTR WT質粒上與miR-29b互補配對的位點進行突變,成為Luc-LOX 3'UTR Mut質粒,與正常的Luc-LOX 3'UTR質粒組進行比較,明確LOX是否為miR-29b的靶基因。使用Western blot法檢測改變miR-29b的表達水平是否能夠影響內源性LOX蛋白白的表達水平。4.將miR-29b激動劑Mimics、miR-29b抑制劑Inhibitor以及陰性對照Scramble轉染至ES-2細胞中,并用實時定量PCR法驗證過表達和敲低效率。使用CCK-8法檢測Mimics組、Inhibitor組及Scramble組中細胞增殖能力的改變。使用Transwell法檢測Mimics組、Inhibitor組及Scramble組中細胞侵襲能力的改變。結果:1.檢測卵巢透明細胞癌、癌旁組織及多種卵巢癌細胞系中LOX的表達:1.1免疫組化檢測卵巢透明細胞癌、癌旁組織中LOX的表達:卵巢透明細胞癌癌旁組織中可以檢測到明顯的LOX表達,而卵巢透明細胞癌組織中均未檢測到強表達。LOX陽性產物為棕黃色顆粒,27例卵巢透明細胞癌癌旁組織中表達陽性23例(85.2%),表達陰性為4例(14.8%)。而在卵巢透明細胞癌組織中表達陽性3例(11.1%),表達陰性為23例(88.9%)。1.2 Western blot法檢測多種卵巢癌細胞系中LOX的表達:在正常卵巢上皮細胞中,LOX蛋白呈現較高的表達水平。在人卵巢透明細胞癌細胞ES-2,人卵巢上皮細胞癌細胞OV-1063,人卵巢腺癌細胞SKOV3和人卵巢腺癌細胞OVCAR-3中LOX蛋白表達水平則明顯降低。2.LOX過表達質粒轉染卵巢癌細胞后細胞增殖、侵襲能力的變化:轉染LOX過表達質粒24小時(24 h)、48小時(48 h)和72小時(72 h)后,ES-2細胞增殖能力受到明顯抑制。轉染LOX過表達質粒48小時后,ES-2細胞的侵襲能力受到明顯抑制。差異有統(tǒng)計學意義,p0.05。3.熒光素酶報告系統(tǒng)及Western blot驗證miR-29b對LOX表達的調控:ES-2中miR-29b出現異常高表達,而OV-1063、SKOV3和OVCAR-3中miR-29b 未見有異常表達。將 Luc-LOX 3' UTR WT 與 Luc-LOX 3' UTR Mut分別轉染至ES-2和SKOV3中,miR-29b表達較高的ES-2細胞中,Mut組熒光素酶活性較WT組明顯升高;而在miR-29b表達較低的SKOV3細胞中,Mut組和WT組熒光素酶活性大致相等。將Luc-LOX 3 ' UTR WT與Luc-LOX 3 ' UTR Mut分別轉染至Hela細胞中,再同時過表達miR-29b,則Luc-LOX 3 ' UTR WT組中過表達miR-29b能夠有效地降低熒光素酶活性,而Luc-LOX 3' UTR Mut組中則無明顯改變。差異有統(tǒng)計學意義,p0.05。4.miR-29b過表達及敲除實驗檢測miR-29b對卵巢透明細胞癌細胞增殖、侵襲能力的影響:轉染構建miR-29b過表達和敲低體系。CCK-8法結果顯示,Mimics組細胞增殖能力與Scramble組相比并未見明顯變化;而Inhibitor組中ES-2細胞的增殖能力受到明顯抑制。Transwell法結果顯示,Mimics組細胞侵襲能力與Scramble組相比并未見明顯變化;而Inhibitor組中ES-2細胞的侵襲能力受到明顯抑制。差異有統(tǒng)計學意義,p0.05。結論:1.LOX蛋白水平在卵巢透明細胞癌組織標本和多種卵巢癌細胞系中表達明顯下調。2.過表達LOX能夠抑制卵巢透明細胞癌細胞的增殖和侵襲能力。3.LOX是miR-29b的靶基因,miR-29b能夠轉錄后抑制LOX的蛋白表達水平。4.敲低內源性miR-29b表達能夠抑制卵巢透明細胞癌細胞增殖和侵襲能力,效應與過表達LOX類似。
[Abstract]:The expression of LOX in different types of tumor cell lines and primary tumors is not identical . The expression of LOX in different types of tumors is not identical . It is suggested that the expression of miR - 29b can be used as a marker for the early diagnosis and development of ovarian cancer . The expression levels of LOX in ovarian clear cell carcinoma cells were detected by Western blot . The expression level of LOX in human ovarian cancer cells was determined by Western blot . The expression level of LOX in ovarian clear cell carcinoma cell line ES - 2 was significantly lower than that in WT group . The expression of miR - 29b in ovarian clear cell carcinoma was significantly lower than that in Scramble group .
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.31

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本文編號：1955903