本文選題：結(jié)腸癌 + 溶瘤腺病毒�。� 參考：《首都醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景:結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是全球第三大常見的惡性腫瘤,占惡性腫瘤致死的第四位[1]。近年來隨著生活習(xí)慣的改變和人口結(jié)構(gòu)的老齡化,結(jié)腸癌逐漸成為危害我國居民健康的重大疾病,2015年我國結(jié)直腸癌新發(fā)病例和死亡病例分別為376300例和19100例,且發(fā)病率呈上升趨勢[2]。結(jié)腸癌目前的治療手段包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療等,盡管這些治療方法取得了巨大進步,但絕大部分病人最終死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此,探索一種針對結(jié)腸癌更加有效的治療手段迫在眉睫。基因治療能有效作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵節(jié)點,是目前腫瘤研究的熱點領(lǐng)域。溶瘤腺病毒能在腫瘤細胞中特異性的復(fù)制并裂解腫瘤細胞,進而釋放的病毒感染鄰近腫瘤細胞,發(fā)揮級聯(lián)放大作用。此外,溶瘤腺病毒裂解腫瘤細胞釋放的腫瘤抗原,可激活局部和全身抗腫瘤免疫,從而達到治療腫瘤的目的;同時,溶瘤腺病毒能夠介導(dǎo)治療基因在腫瘤局部的高效表達。Decorin是富含亮氨酸小分子蛋白聚糖(prototypic member of the small leucine-rich proteoglycans,SLRPs)家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn),decorin在細胞粘附、遷移、增殖、凋亡、自噬、分化、炎癥和腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中均發(fā)揮重要作用。目前已有多項研究證實,decorin在多種腫瘤組織中表達下調(diào)。粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF),具有促進巨噬細胞和樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)成熟與分化等作用,已在多項臨床研究中證實具有顯著的抗腫瘤作用。因此,我們以溶瘤腺病毒為載體,以decorin和GM-CSF為治療基因構(gòu)建溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM,評價其體內(nèi)外抗腫瘤作用和免疫激活作用并探索其機制。目的:將溶瘤腺病毒與治療基因相結(jié)合,構(gòu)建攜帶治療基因decorin和GM-CSF的溶瘤腺病毒,評價其體內(nèi)外抗腫瘤作用和免疫激活作用并探索其機制。材料和方法:首先,收集我院2010年1月至2013年12月共59例結(jié)直腸手術(shù)病人的腫瘤組織、癌旁組織和正常腸組織,根據(jù)病理分析結(jié)果進行凍存;收集病人住院資料及隨訪資料;采用real-time RT-PCR和免疫組化檢測腫瘤組織和相應(yīng)的正常組織中decorin的表達水平,同時,采用real-time RT-PCR檢測decorin靶基因Met和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的表達水平。其次,采用Adeasy系統(tǒng)構(gòu)建攜帶decorin基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒質(zhì)粒pAd.DCN,并在HEK293細胞中包裝獲得重組腺病毒Ad.DCN。然后,我們在HEK293細胞中大量擴增復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad.Null、Ad.DCN,和溶瘤腺病毒rAd.Null、rAd.DCN、rAd.GM和rAd.DCN.GM,然后采用CsCl密度梯度離心純化病毒,采用紫外分光光度法測定病毒的顆粒滴度和純度。再次,在結(jié)腸癌細胞中,對溶瘤腺病毒的體外功能進行評價。分別采用溶瘤腺病毒和復(fù)制缺陷型重組腺病毒感染結(jié)腸癌細胞SW480、SW620和CT26.WT,然后,采用病毒噬斑擴增法測定病毒在結(jié)腸癌細胞中的復(fù)制能力;采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中decorin和GM-CSF的表達水平;采用磺酰羅丹明B(sulforhodamine B,SRB)染色法檢測溶瘤病毒對結(jié)腸癌細胞的殺傷效應(yīng)。同時,分離結(jié)直腸癌病人的外周血單個核細胞,采用溶瘤腺病毒感染的結(jié)腸癌細胞制備條件培養(yǎng)液,用條件培養(yǎng)液刺激單個核細胞后,檢測單個核細胞的增殖能力和細胞因子的表達水平。最后,采用小鼠CT26.WT細胞在Balb/c小鼠建立具有完全免疫系統(tǒng)的皮下結(jié)腸癌模型,然后,采用瘤內(nèi)注射溶瘤腺病毒的方式進行治療,觀察小鼠的健康狀態(tài)、腫瘤的生長曲線,通過病理檢測腫瘤及各臟器,采用流式細胞術(shù)檢測免疫細胞的表型,通過real-time PCR檢測目的基因、decorin靶基因、細胞因子和化學(xué)趨化因子表達等,進而評價溶瘤腺病毒對結(jié)腸癌的治療作用和機制。結(jié)果:在結(jié)直腸癌病人腫瘤組織中,decorin蛋白和mRNA的表達顯著下調(diào)。其中31例結(jié)腸癌病人的腫瘤組織中,有28例的decorin表達下調(diào);28例直腸癌病人中,26例表達下調(diào)。并且,decorin的表達水平與直腸癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。同時,我們發(fā)現(xiàn),decorin表達下調(diào)可以上調(diào)其主要靶基因Met和VEGFA的表達水平,可能與腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。接下來,我們成功構(gòu)建攜帶decorin(DCN)和GM-CSF(GM)的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM及其對照病毒rAd.Null、rAd.DCN、rAd.GM;同時,還成功制備了復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad.Null和Ad.DCN。成功擴增和純化得到高質(zhì)量的病毒產(chǎn)品,用于體外和體內(nèi)功能的評價。然后,體外實驗證實溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM能夠發(fā)揮體外溶瘤功能并介導(dǎo)目的基因的高效表達。(1)ELISA結(jié)果顯示,rAd.DCN.GM、rAd.DCN和Ad.DCN能夠有效表達decorin蛋白,而rAd.DCN.GM和rAd.GM可有效表達目的蛋白GM-CSF;(2)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM在人結(jié)腸癌細胞系SW480和SW620中復(fù)制能力明顯高于復(fù)制缺陷型腺病毒;而在小鼠結(jié)腸癌細胞CT26.WT細胞中,沒有檢測到溶瘤腺病毒明顯的復(fù)制能力;(3)SRB檢測結(jié)果顯示,溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM對人結(jié)腸癌細胞系SW480、SW620和鼠結(jié)腸癌細胞系CT26.WT均能產(chǎn)生顯著的細胞毒性作用;(4)復(fù)制缺陷型腺病毒Ad.DCN感染SW480的結(jié)果顯示,decorin能顯著下調(diào)重要靶基因c-Met、VEGFA、CNTTB1、TGF-β的mRNA表達。同時,有效抑制結(jié)腸癌細胞的遷移;(5)溶瘤腺病毒感染SW480的細胞裂解液,能夠激活人外周血單個核細胞中多種細胞因子的表達。最后,我們成功建立了具有正常免疫系統(tǒng)的Balb/c小鼠結(jié)腸癌移植瘤模型(CT26.WT皮下移植瘤),在體內(nèi)對溶瘤腺病毒的抗腫瘤及免疫激活作用進行評價。主要結(jié)果包括:(1)溶瘤腺病毒能夠有效抑制結(jié)腸癌移植瘤的生長,而攜帶目的基因的溶瘤腺病毒具有更強的腫瘤抑制作用;(2)病理檢測結(jié)果顯示,溶瘤腺病毒沒有顯著的肝臟和脾臟毒性;溶瘤腺病毒能夠促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖,并抑制腫瘤的肺轉(zhuǎn)移,其中,rAd.DCN.GM對肺轉(zhuǎn)移具有最強的抑制效應(yīng);(3)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM介導(dǎo)目的基因decorin和GM-CSF在腫瘤局部的高效表達,可上調(diào)E-cadherin、下調(diào)VEGFA、N-cadherin和Vimentin的表達;增強化學(xué)趨化因子perforin和granzyme B的表達;(4)溶瘤腺病毒可提升外周血中CD8+T淋巴細胞的比例;促進脾臟中DCs的分化和成熟;抑制脾臟內(nèi)Th2型細胞因子IL-6、TNF-α和TGF-β的表達;促進脾臟INF-γ的表達。結(jié)論:結(jié)直腸癌病人腫瘤組織中decorin表達顯著下調(diào),且與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān);本研究成功制備了攜帶decorin和GM-CSF基因的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM,rAd.DCN.GM能夠在結(jié)腸癌細胞中有效復(fù)制并殺傷腫瘤細胞,同時,高效介導(dǎo)目的基因decorin和GM-CSF的表達;rAd.DCN.GM能夠有效抑制結(jié)腸癌CT26.WT移植瘤的生長,激活抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此,rAd.DCN.GM有望發(fā)展成為治療結(jié)腸癌的基因治療候選藥物。
[Abstract]:Background : Colorectal cancer ( colorectal cancer ) is the third most common malignant tumor in the world . In recent years , with the change of living habits and the aging of population structure , colon cancer has become a major disease which endangers the health of our population . In 2015 , the incidence of new cases and deaths of colorectal cancer in China is 376300 cases and 19100 cases , respectively , and the incidence rate is rising . 緇撹偁鐧岀洰鍓嶇殑娌葷枟鎵嬫鍖呮嫭鎵嬫湳,鏀劇枟,鍖栫枟,闈跺悜娌葷枟絳，

本文編號：1927212