本文選題：miR-647 + 胃癌　； 參考：《廣西醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：1背景與目的胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,在世界范圍內(nèi),胃癌位居腫瘤死亡的第二位。中國是胃癌高發(fā)國家,全世界每年新發(fā)生的胃癌為75.5萬例,約35%發(fā)生在中國;胃癌的早期癥狀不明顯,確診胃癌時約有40%的患者已經(jīng)伴有遠處轉(zhuǎn)移。目前臨床上主要運用放療,化療,手術(shù)等手段治療胃癌,但其總體死亡率并沒有得到明顯下降,進展期胃癌腫瘤組織的快速生長和遠處轉(zhuǎn)移是引起胃癌高死亡率的主要原因。與傳統(tǒng)治療相比,基因治療具有靶向精準,特異性強,副作用小等優(yōu)點,2004年1月我國研發(fā)的用于頭頸部治療腫瘤治療的重組p53腺病毒注射液,在全球率先上市。盡管大量的研究已經(jīng)報道了胃癌發(fā)生發(fā)展的機制,但是其發(fā)病的病理生理學改變?nèi)圆幻鞔_。因此,進一步探索胃癌發(fā)生發(fā)展的靶向治療因子是早期診斷和治療胃癌以及降低其死亡率的重要突破口。近年研究發(fā)現(xiàn),微小RNA(miRNA、micro RNA)作為內(nèi)源性非編碼RNA具有靶向抑制其下游基因表達的生物學特性,與細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物進程相關(guān),調(diào)控包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病,有望成為腫瘤治療的靶向基因。由于micro RNA可靶向調(diào)控數(shù)百個基因的表達,其在惡性腫瘤的診斷和治療方面顯示出了非常好的應(yīng)用前景。近年研究發(fā)現(xiàn),miRNAs參與調(diào)節(jié)包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,同時Rawlings-Goss等發(fā)現(xiàn)miR-647與多種腫瘤相關(guān)并能作為胃癌發(fā)生發(fā)展的生物學標記物,但作用機制尚不明確。為進一步探討miR-647在胃癌發(fā)生發(fā)展的作用,本研究首先擬通過熒光定量PCR方法檢測人胃癌組織、人胃癌細胞株中miR-647表達情況,并分析其表達與臨床病理特征(年齡、性別、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移和病理分型等)的相關(guān)性,以期明確miR-647表達在胃癌診斷和預后中的意義。進一步構(gòu)建miR-647過表達慢病毒載體,通過體內(nèi)實驗與體外實驗觀察miR-647對胃癌細胞的作用,運用基因芯片、生物學預測軟件、熒光定量PCR和Western Blot蛋白印記實驗探討其作用機制,以期明確miR-647在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用與機制。2方法2.1提取胃癌組織與胃癌細胞的總RNA(Trizol法),應(yīng)用熒光定量PCR比較胃癌組織與正常癌旁組織,胃癌細胞與正常胃黏膜上皮細胞中miR-647的表達情況,進一步分析miR-647表達與胃癌患者臨床病理特征(年齡、性別、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移和病理分型等)的相關(guān)性;Transwell檢測人胃癌細胞株HGC-27、AGS、SGC-7901、MGC-803的侵襲能力。2.2構(gòu)建miR-647過表達的慢病毒載體,陽性重組克隆進行序列驗證;采用miR-647過表達的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株SGC-7901和MGC-803,其中空白組(Ctrl組)不做任何處理常規(guī)培養(yǎng)細胞,陰性組(NC組)轉(zhuǎn)染空病毒載體,實驗組(647組)轉(zhuǎn)染miR-647過表達的慢病毒載體,嘌呤霉素篩選成功轉(zhuǎn)染的細胞株,熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染胃癌細胞株SGC-7901和MGC-803中miR-647的表達;CCK-8法檢測miR-647過表達對胃癌細胞增殖的影響;流式細胞檢測miR-647過表達對胃癌細胞周期和凋亡的影響;電鏡下觀察miR-647對胃癌細胞的微觀形態(tài)改變;將成功轉(zhuǎn)染miR-647過表達慢病毒顆粒的人胃癌細胞株細胞懸液100ul(2x107個/ml)接種于5~6周裸鼠腋下(8只/組),每三天測量瘤體長短徑一次并計算腫瘤大小,21天后脫頸法處死裸鼠,HE法確認腫瘤組織。2.3劃痕實驗與Transwell實驗分別檢測miR-647對人胃癌細胞遷徙能力和侵襲能力的影響;將成功轉(zhuǎn)染miR-647過表達慢病毒顆粒的人胃癌細胞株細胞懸液100ul(8x105個/ml)注射入5~6周齡裸鼠尾靜脈(10只/組),36天后脫頸法處死裸鼠,HE染色檢測胃癌轉(zhuǎn)移模型的肝肺轉(zhuǎn)移情況。2.4采用人類全基因組表達芯片譜檢測miR-647過表達后人胃癌MGC-803的差異表達基因;生物信息學軟件預測miR-647的靶基因;熒光定量PCR和Western Blot蛋白印跡實驗檢測miR-647預測靶基因ANK2以及其下游FAK、MMP2、MMP12、CD44、SNAIL1的m RNA與蛋白的表達情況。3.結(jié)果3.1熒光定量PCR結(jié)果顯示,與對應(yīng)癌旁正常組織相比,在70例胃癌患者中43例患者胃癌組織中miR-647表達量下降,占61.43%;在70例胃癌病人中,與對應(yīng)癌旁正常組織相比,miR-647表達量明顯下調(diào)(P0.05);與胃黏膜正常細胞株GES-1相比,miR-647在人胃癌細胞株HGC-27,AGS,SGC-7901和MGC-803中表達下調(diào)(P0.05),Transwell結(jié)果顯示,與胃癌細胞株HGC-27和AGS相比,SGC-7901和MGC-803具有更強的侵襲能力且miR-647表達量與侵襲能力呈負相關(guān)(P0.05)。臨床病理資料分析結(jié)果表明miR-647的表達量與胃癌組織的腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05)。3.2陽性重組克隆測序結(jié)果顯示miR-647過表達載體序列正確;熒光定量PCR顯示,miR-647過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株SGC-7901、MGC-803后miR-647表達量上調(diào)(P0.05);CCK-8法提示,與NC組與Ctrl組相比,miR-647過表達的647組SGC-7901和MGC-803的細胞增殖能力降低(P0.05);流式細胞儀檢測顯示與NC組與Ctrl組相比,miR-647過表達的647組SGC-7901和MGC-803的細胞周期阻滯在G0/G1期(P0.05),凋亡率增加(P0.05);透射電鏡提示在647組SGC-7901和MGC-803中能觀察到細胞凋亡的典型特征;裸鼠瘤體內(nèi)實驗顯示,與NC組與Ctrl組相比,miR-647過表達的647組SGC-7901和MGC-803的裸鼠皮下移植瘤模型生長較慢(P0.05);HE染色顯示皮下移植瘤體為惡性腫瘤組織。3.3劃痕實驗結(jié)果顯示,與NC組與Ctrl組相比,miR-647過表達的647組SGC-7901和MGC-803細胞遷移能力下降(P0.05);Transwell實驗結(jié)果顯示,與NC組與Ctrl組相比,miR-647過表達的647組SGC-7901和MGC-803細胞侵襲能力下降(P0.05);轉(zhuǎn)移瘤模型結(jié)果顯示,與NC組(50%)與Ctrl組(70%)相比,miR-647過表達的647組SGC-7901細胞肝轉(zhuǎn)移率為10%,轉(zhuǎn)移率明顯降低(P0.05)。3.4全基因組檢測31741個基因,803-647與803-NC組相比,一共223個基因差異性表達(篩選條件為log2"#Flod change"#"g1.5,P㩳0.05),其中上調(diào)基因數(shù)為113個,下調(diào)基因數(shù)為110個;miRanda,Target Scan和micro RNA三個生物學預測軟件顯示,至少兩個預測軟件預測的miR-647的靶基因交集有382個;芯片表達差異下調(diào)基因和生物信息學軟件預測靶基因的交集為ANK2、ZNF609、KNDC1和TRIM4;熒光定量PCR顯示,ANK2與KNDC1在SGC-7901和MGC-803兩株細胞中均下調(diào)(P0.05);由于只有ANK2與腫瘤發(fā)生相關(guān),我們擬定ANK2為miR-647的下游靶基因的研究對象;同時Western Blot結(jié)果表明miR-647在SGC-7901和MGC-803兩株細胞細胞中抑制ANK2蛋白表達(P0.05);熒光定量PCR和Western Blot蛋白印跡實驗結(jié)果顯示,與NC組與Ctrl組相比,miR-647過表達的647組中miR-647下游FAK、MMP2、MMP12、CD44、SNAIL1的m RNA與蛋白表達均下調(diào)(P0.05)。4.結(jié)論4.1 miR-647在胃癌組織中的表達低于癌旁正常組織,且與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān);miR-647在胃癌細胞株中的表達低于胃黏膜正常上皮細胞株且其表達量與細胞的侵襲能力呈負相關(guān)。4.2成功構(gòu)建miR-647過表達慢病毒載體與miR-647過表達人胃癌細胞株SGC-7901和MGC-803;miR-647過表達在體外能抑制人胃癌細胞株SGC-7901和MGC-803的增殖,使細胞發(fā)生G0/G1期阻滯,凋亡增加;同時,在體內(nèi)能抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生長。4.3 miR-647過表達能在體內(nèi)外抑制人胃癌細胞株SGC-7901和MGC-803的轉(zhuǎn)移能力。4.4 ANK2可能為miR-647的直接靶基因,miR-647過表達可使人胃癌細胞株SGC-7901和MGC-803的ANK2和FAK、MMP2、MMP12、CD44、SNAIL1的m RNA與蛋白表達降低。創(chuàng)新點1.微小RNA與細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物進程密切相關(guān),調(diào)控包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病,本研究通過檢測miR-647在胃癌組織中的表達,并進一步分析其與臨床病理特征的關(guān)系,初步闡明了miR-647在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。2.本研究應(yīng)用分子生物學技術(shù)構(gòu)建目的miR-647的慢病毒載體,從增殖和轉(zhuǎn)移兩個方面觀察其對胃癌細胞生物學行為的影響,并進一步探討miR-647在胃癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機制,以期為胃癌的早期診斷和治療提供新的方向。
[Abstract]:In recent years , it has been found that microRNAs ( miRNA , micro RNA ) can be used as endogenous non - coding RNAs to treat gastric cancer . The expression of miR - 647 in gastric cancer cells was determined by fluorescence quantitative PCR , and the expression of miR - 647 in gastric cancer cell line SGC - 790and MGC - 803 was detected by MTT assay . The expression of miR - 647 overexpression in gastric cancer cell line SGC - 790and MGC - 803 was detected by immunohistochemistry . The expression of miR - 647 was detected by fluorescence quantitative PCR and Western Blot . Compared with the control group , the expression of miR - 647 was decreased ( P0.05 ) . Compared with the control group , the expression of miR - 647 was decreased ( P0.05 ) . Compared with the control group , the expression of miR - 647 was decreased ( P0.05 ) . The expression of miR - 647 in gastric cancer cells was lower than that of normal epithelial cells in gastric cancer .

【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：1854079