本文關鍵詞：SEMA3F通過抑制Rac1調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞干性的機制及臨床病理學意義　出處：《第三軍醫(yī)大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：結(jié)直腸癌是嚴重危害人類健康的惡性消化道腫瘤,《全球癌癥報告2014》數(shù)據(jù)提示中國新增的癌癥例數(shù)及死亡人數(shù)的總和居世界首位,其中以包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的消化道惡性腫瘤與其他系統(tǒng)腫瘤相比發(fā)生率較高。因此,深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展的主要機制,探討腫瘤形成過程中的分子基礎及作用機制,將為未來的結(jié)直腸癌患者的個性靶向治療提供新的理論基礎。近年來,腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)理論的提出為結(jié)直腸癌的治療提供了新的思路。我們前期研究證實神經(jīng)軸突導向分子SEMA3F具有抑制結(jié)直腸癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能及體內(nèi)成瘤能力,但SEMA3F對腫瘤細胞干性特征的影響及分子機制未見報道。神經(jīng)叢素A1(Plexin A1)作為SEMA3F的受體,胞內(nèi)具有能夠活化GTPase的結(jié)構域,使其實現(xiàn)GDP非激活形式與GTP激活形式的轉(zhuǎn)換,它可以傳導SEMA3F對細胞的增殖、遷移及運動能力的調(diào)節(jié)。近年來研究發(fā)現(xiàn),GTPase還能夠參與腫瘤干細胞的干性維持。同時我們前期預實驗結(jié)果提示結(jié)直腸癌干細胞低表達軸突導向因子SEMA3F,此外,SEMA3F的表達還與腫瘤的惡性程度呈負相關關系,提示神經(jīng)軸突誘導因子SEMA3F可能在腫瘤的起始過程中發(fā)揮著重要作用。因此我們推測SEMA3F可能通過靶向GTPase對結(jié)直腸癌細胞的干性特征具有抑制作用。在本研究中,我們通過體內(nèi)構建SEMA3F Sh RNA干擾載體及過表達的慢病毒,將其轉(zhuǎn)導至人結(jié)直腸癌細胞系,觀察調(diào)節(jié)SEMA3F的表達對結(jié)直腸癌細胞的自我更新能力及體內(nèi)成瘤能力的影響,觀測調(diào)節(jié)SEMA3F的表達對相關信號通路的影響,特別是Wnt/β-Catenin信號通路激活的影響。重點檢測了GTPase在改變調(diào)節(jié)SEMA3F表達后的改變情況,通過外源性抑制劑及小干擾RNA的處理,驗證其在SEMA3F調(diào)控結(jié)直腸癌細胞干性特征過程中的作用。最后,我們調(diào)研了人類結(jié)直腸癌標本中SEMA3F和LGR5以及GTP-Rac1的表達狀況,探尋三者與腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移相關的腫瘤病理學特征之間的關系。主要結(jié)果和結(jié)論如下:1.SEMA3F可以顯著抑制結(jié)直腸癌細胞的干性特征;(1)過表達SEMA3F的表達后可以顯著抑制結(jié)直腸癌細胞系中相關干性基因的表達(如Nanog、Oct4、Sox2);(2)干擾SEMA3F的表達后可以顯著增強結(jié)直腸癌細胞中的Nanog、Oct4、Sox2的表達水平;(3)上調(diào)SEMA3F的表達后可以顯著抑制結(jié)直腸癌細胞系HCT116的LGR5的表達水平;(4)上調(diào)SEMA3F的表達后可以顯著抑制結(jié)直腸癌細胞系HCT116的LGR5陽性群體的比例(3.31%±0.33%、4.0%±0.83%,0.75%±0.15%,p0.05);(5)上調(diào)SEMA3F的表達后結(jié)直腸癌細胞系HCT116的克隆形成率由21.67±1.63%、21±1.70%下降到12.0±0.82%(p0.05),而結(jié)直腸癌細胞HCT116成球能力則由22.33±2.78%、20.67±1.72%下降到8±1.47%(p0.05);(6)干擾SEMA3F的表達后可以顯著增加結(jié)直腸癌細胞系HCT116的LGR5的蛋白表達水平及LGR5陽性群體的比例(3.31%±0.33%、4.0%±0.83%,8.92%±1.15%,p0.05);(7)干擾SEMA3F的表達后,結(jié)直腸癌細胞系HCT116細胞克隆形成能力由20.83±0.76%、20.33±2.02%上升到26.83±1.26%(p0.05),而細胞的成球能力則由28.0±2.64%、23.67±2.06%上升到47.67±2.74%,具有顯著的統(tǒng)計學意義(p0.05);(8)干擾SEMA3F的表達后可以顯著增加結(jié)直腸癌細胞系HCT116的體內(nèi)成瘤能力,無論是腫瘤的發(fā)生率還是腫瘤的生長速度,干擾SEMA3F的結(jié)直腸癌細胞都明顯優(yōu)于對照組,而當同時注射1×106個結(jié)直腸癌細胞時,干擾組的結(jié)直腸癌細胞形成的移植瘤的體積(347.872±90.66mm3、277.35±54.166 mm3 VS 1025.96±169.5mm3,p0.05)與重量(0.0299±0.029g、0.068±0.006g VS 0.4426±0.1279g,p0.05)都顯著高于對照組。2.SEMA3F的表達可以使Wnt信號通路的激活受到抑制;(1)上調(diào)SEMA3F的表達后可以顯著抑制結(jié)直腸癌細胞系HCT116中Wnt信號通路的活性(0.489±0.06、0.465±0.08 VS 0.15±0.005,p0.05),同時β-catenin的表達水平也被明顯抑制;(2)干擾SEMA3F的表達后可以顯著增加結(jié)直腸癌細胞系HCT116中Wnt信號通路的活性,熒光值由1.59±0.06、1.19±0.09增加到6.56±0.79,且具有明顯的統(tǒng)計學意義(p0.05);(3)干擾SEMA3F的表達后可以顯著增加結(jié)直腸癌細胞系HCT116中總β-catenin的表達水平,進一步檢測發(fā)現(xiàn),胞漿中的β-catenin無明顯改變,干擾組中胞核的β-catenin的表達水平上調(diào)。3.GTP-Rac1介導了SEMA3F對結(jié)直腸癌干性特征的調(diào)控;(1)干擾SEMA3F的表達后可以顯著上調(diào)基因ARHGEF7及GTPBP4的表達水平;(2)過表達結(jié)直腸癌細胞的SEMA3F表達水平后可以顯著抑制基因ARHGEF7及GTPBP4的表達水平;(3)干擾SEMA3F的表達后可以顯著增加結(jié)直腸癌細胞系中的GTP-Rac1激活;(4)過表達結(jié)直腸癌細胞SEMA3F的表達水平后可以顯著抑制結(jié)直腸癌細胞系中GTP-Rac1的激活;(5)對于結(jié)直腸癌細胞系HCT116而言,外源性GTP-Rac1的抑制劑NSC23766的有效藥物濃度為75u M,而LGR5、β-Catenin、Nanog、Oct4、Sox2及GTP-Rac1的表達水平皆隨藥物濃度的增高而降低;(6)用75m M外源性GTP-Rac1的抑制劑NSC23766處理干擾組及對照組細胞時,敲低SEMA3F所導致的LGR5、β-Catenin、Nanog、Oct4、Sox2上調(diào)均能被逆轉(zhuǎn);(7)用75m M外源性GTP-Rac1的抑制劑NSC23766處理干擾SEMA3F及對照組結(jié)直腸癌細胞HCT116及SW480時,敲低SEMA3F所引起的細胞克隆形成能力及成球能力的上調(diào)均能被逆轉(zhuǎn);(8)用75m M外源性GTP-Rac1的抑制劑NSC23766處理過表達SEMA3F及對照組結(jié)直腸癌細胞HCT116時,SEMA3F抑制細胞克隆形成能力及成球能力的現(xiàn)象能得到增強;(9)用小干擾RNA處理干擾組及對照組細胞時,發(fā)現(xiàn)干擾SEMA3F所引起的LGR5、β-Catenin、Nanog、Oct4、Sox2的上調(diào)也能被逆轉(zhuǎn)。4.人類結(jié)直腸癌標本中SEMA3F和LGR5以及GTP-Rac1的表達狀況及臨床意義(1)SEMA3F表達定位于正常組織黏膜上皮細胞及早期結(jié)直腸癌組織的胞漿中,隨著腫瘤級別的增高而呈遞減趨勢,SEMA3F的表達與結(jié)直腸癌的遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及病人的復發(fā)臨床病理特征顯著負相關,同時SEMA3F高表達的病人其預后較好;(2)GTP-Rac1高表達于結(jié)直腸癌組織中,隨著腫瘤患者TNM分期的增高而呈遞增趨勢,其表達水平與結(jié)直腸癌的遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及復發(fā)等病理特征呈明顯正相關關系,且GTP-Rac1表達水平高的病人其預后往往較差;(3)LGR5高表達于結(jié)直腸癌腫瘤組織及腫瘤侵襲前緣,其表達水平與結(jié)直腸癌復發(fā)、腫瘤的侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等病理特征呈明顯正相關關系,而高表達LGR5的病人預后較差,通過免疫熒光及免疫組化雙標,SEMA3F及LGR5的表達無明顯的共定位現(xiàn)象,呈現(xiàn)“此起彼伏”的表達現(xiàn)象;(4)SEMA3F的表達與GTP-Rac1的表達呈明顯負相關關系,SEMA3F高表達的病人其GTP-Rac1的表達水平較低,同時SEMA3FlowGTP-Rac1high病人的生存期最短,單因素及多因素分析提示聯(lián)合GTP-Rac1及SEMA3F是結(jié)直腸癌獨立的預后指標;本文總結(jié)如下:SEMA3F可以抑制結(jié)直腸癌細胞的自我更新能力,敲低SEMA3F的表達后,結(jié)直腸癌細胞的體內(nèi)成瘤能力得到了增強;SEMA3F的表達可以抑制Wnt信號通路的活性;Rac1的激活在SEMA3F介導的干性特征抑制發(fā)揮著重要作用,并且不依賴于APC突變;SEMA3F的表達與臨床病理參數(shù)成負相關,GTP-Rac1的表達與臨床病理參數(shù)成正相關,與患者的生存時間正負相關,聯(lián)合SEMA3F及GTP-Rac1的表達是結(jié)直腸癌患者獨立的預后指標。
[Abstract]:In recent years , we have investigated the effects of SEMA3F on the cell proliferation , migration and motility of colorectal cancer cells . In recent years , we have investigated the effects of SEMA3F on the cell proliferation , migration and motility of colorectal cancer . ( 5 ) After the expression of SEMA3F , the growth rate of HCT116 in colorectal cancer cell line HCT116 decreased from 20.83 鹵 2.78 % , 20.67 鹵 2.06 % to 26.83 鹵 1.26 % ( P < 0.05 ) . The expression level of SEMA3F and LGR5 and GTP - Rac1 were significantly correlated with the expression of SEMA3F and control group . SEMA3F can inhibit the self - renewal ability of colorectal cancer cells , and the expression of SEMA3F can inhibit the activity of Wnt signaling pathway . The expression of SEMA3F can inhibit the activity of Wnt signaling pathway .

【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

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