本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用熒光探針技術(shù)檢測口腔鱗癌細(xì)胞在氧化性應(yīng)激及凋亡過程中谷胱甘肽水平的變化　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:口腔黏膜鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤,雖然目前采取了綜合序列治療手段,但仍存在著復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率高,尤其是晚期鱗癌患者,5年生存率仍然較低,預(yù)后較差。化療是目前口腔鱗癌的主要治療方法之一,但臨床上越來越多的化療藥物耐藥性的出現(xiàn)也是制約化療療效的最大的瓶頸。一些常用的化療藥物包括順鉑等一個重要的作用機(jī)制就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxigen species,ROS)的形成,同時(shí),哺乳動物細(xì)胞內(nèi)存在的大量的酶或者非酶類的抗氧化劑以對抗氧化劑包括活性氧的存在。一方面,在生理情況下,細(xì)胞內(nèi)的氧化劑和非氧化劑保持著動態(tài)的平衡狀態(tài),另一方面,在腫瘤治療過程中,抗氧化劑也可能對抗ROS的作用而減弱甚至抑制化療藥物的作用。谷胱甘肽(GSH)作為最主要的氧化還原調(diào)節(jié)器,緊密地控制著細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡,同時(shí)也與藥物耐藥緊密相關(guān)。迄今為止,已研究出一些特異性的谷胱甘肽探針,選擇性的和定量的檢測細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的變化。然而,就我們所知,目前尚沒有任何一種探針被應(yīng)用于顯示通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的過程。這次我們應(yīng)用了一種新穎的選擇性的谷胱甘肽熒光探針來實(shí)時(shí)檢測口腔鱗癌細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平的變化,及進(jìn)一步實(shí)時(shí)檢測在外源性氧化性損害及線粒體內(nèi)谷胱甘肽清除后引起的氧化性應(yīng)激及凋亡過程中谷胱甘肽水平的變化。通過本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步了解谷胱甘肽尤其是線粒體內(nèi)谷胱甘肽水平對細(xì)胞氧化性應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響。方法:1.檢測細(xì)胞內(nèi)GSH濃度變化:口腔鱗癌cal-27細(xì)胞在100μMH2O2,1mMNAC及5050μM EA連續(xù)作用后,用谷胱甘肽探針顯示試驗(yàn)前后谷胱甘肽的水平變化,在共聚焦顯微鏡下藍(lán)色熒光代表著細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的水平。2.檢測治療前后細(xì)胞內(nèi)GSH及ROS濃度變化:口腔鱗癌cal-27細(xì)胞在H2O2及EA作用后,應(yīng)用GSH探針和DCF-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)GSH和ROS的水平變化。在共聚焦顯微鏡下顯示藍(lán)色熒光代表細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平,綠色熒光代表細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。3.檢測治療前后線粒體內(nèi)GSH及ROS濃度變化:口腔鱗癌cal-27細(xì)胞在H2O2及EA作用后,應(yīng)用Mitotracker Red CM-H2XRos定位細(xì)胞線粒體,GSH探針和DCF-DA探針檢測線粒體內(nèi)GSH和ROS的水平變化。在共聚焦顯微鏡下顯示紅色熒光代表細(xì)胞線粒體,藍(lán)色熒光代表細(xì)胞內(nèi)GSH濃度,綠色熒光代表ROS濃度。4.檢測治療前后細(xì)胞GSH濃度變化和細(xì)胞凋亡:口腔鱗癌cal-27細(xì)胞在H2O2及EA作用后,應(yīng)用Annexin V-FITC探針檢測細(xì)胞凋亡,GSH探針檢測細(xì)胞內(nèi)GSH濃度變化。在共聚焦顯微鏡下顯示綠色熒光代表細(xì)胞凋亡的發(fā)生,藍(lán)色熒光代表細(xì)胞內(nèi)GSH濃度。5.檢測線粒體跨膜電位和谷胱甘肽口腔鱗癌cal-27細(xì)胞在H2O2及EA作用后,應(yīng)用JC-1探針檢測線粒體跨膜電位,GSH探針檢測細(xì)胞內(nèi)GSH濃度變化。在共聚焦顯微鏡下顯示紅色熒光代表線粒體跨膜電位的發(fā)生,藍(lán)色熒光代表細(xì)胞內(nèi)GSH濃度。結(jié)果:1.藥物作用前,細(xì)胞顯示明亮的藍(lán)色,在100μM H2O2作用半個小時(shí)后,藍(lán)色熒光減弱,1mM NAC作用1h后,藍(lán)色熒光增強(qiáng),緊接著在50μM EA作用30min后,藍(lán)色熒光顯著減弱幾乎消失。2.藥物作用前,細(xì)胞顯示明亮的藍(lán)色熒光和微弱的綠色熒光,在100μM H2O2作用半個小時(shí)后,綠色熒光增強(qiáng)同時(shí)藍(lán)色熒光減弱,在50μM EA作用30min后,綠色熒光明顯增強(qiáng)同時(shí)藍(lán)色熒光明顯減弱。3.細(xì)胞顯示紅色、藍(lán)色和綠色熒光,紅色熒光表示細(xì)胞線粒體,紅色和藍(lán)色熒光合并后為紫色熒光,這是線粒體GSH。紅色和綠色熒光合并后為橙色熒光,這是線粒體ROS。藥物作用前,細(xì)胞發(fā)出明亮的紫色熒光和微弱的橙色熒光。在100μM H2O2作用半個小時(shí)后,紫色熒光減弱,橙色熒光增強(qiáng),在50μM EA作用30min后,橙色熒光明顯增強(qiáng)同時(shí)紫色熒光明顯減弱。4.藥物治療前細(xì)胞顯示明亮的藍(lán)色熒光和微弱的綠色熒光,藍(lán)色熒光代表細(xì)胞內(nèi)GSH濃度,綠色熒光代表細(xì)胞凋亡。在100μM H2O2作用半個小時(shí)后,綠色熒光增強(qiáng)同時(shí)藍(lán)色熒光減弱,在50μM EA作用30min后,綠色熒光明顯增強(qiáng),藍(lán)色熒光明顯減弱。5.藥物作用前,細(xì)胞顯示強(qiáng)烈的藍(lán)色及紅色熒光,表示細(xì)胞內(nèi)高濃度的谷胱甘肽及高位的跨膜電位,在100μM H2O2作用半個小時(shí)后,藍(lán)色及紅色熒光均逐漸減弱,在50μM EA作用30min后,藍(lán)色及紅色熒光減低明顯,幾乎消失。結(jié)論:我們的研究顯示,這種特異性的谷胱甘肽探針能夠被應(yīng)用來在口腔黏膜鱗癌細(xì)胞在H2O2作用及線粒體谷胱甘肽清除作用后發(fā)生的氧化性應(yīng)激及凋亡過程中實(shí)時(shí)、定量的顯示細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量的變化。這種谷胱甘肽探針最大的優(yōu)勢在于我們能夠?qū)崟r(shí)地和定量地觀察到細(xì)胞內(nèi)GSH的變化過程。最后,我們還能得出結(jié)論:清除線粒體內(nèi)的谷胱甘肽能夠促進(jìn)氧化性應(yīng)激誘導(dǎo)的口腔黏膜鱗癌細(xì)胞cal-27的凋亡。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of glutathione ( GSH ) on oxidative stress and apoptosis in oral squamous cell carcinoma . In the presence of H2O2 for 30 min , the fluorescence intensity of blue and blue fluorescence decreased . After 30 min of the action of 100渭M H2O2 , the blue fluorescence increased and the blue fluorescence decreased . After the action of 100渭M H2O2 for 30 min , the blue and red fluorescence decreased . After 30 min of the action of 100渭M H2O2 , the blue and red fluorescence decreased . This specific glutathione probe can be applied to display the changes of GSH content in the cells in real time and in real time during oxidative stress and apoptosis induced by H2O2 and mitochondrial glutathione in oral mucosa squamous carcinoma cells . The greatest advantage of this glutathione probe is that we can observe the changes of GSH in the cells in real time and quantitatively . Finally , we can conclude that the scavenging of glutathione in the mitochondria can promote the apoptosis of the oral mucosa squamous carcinoma cell cal - 27 induced by oxidative stress .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.8

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本文編號：1422807