本文關鍵詞：系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者Toll樣受體9及其相關信號通路的研究　出處：《吉林大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景:機體中遭受病原體感染或者出現(xiàn)組織損傷過程中會釋放出核酸。在正常情況下,體內(nèi)的Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)識別外界入侵的病原微生物的核酸,并激活天然免疫系統(tǒng)以保護機體免受病原微生物損害。但在病理情況下,機體持續(xù)的對自身核酸產(chǎn)生天然免疫應答會導致多種多樣的自身免疫性疾病。TLRs家族中,Toll樣受體9(Toll like receptor 9,TLR9)主要識別雙鏈DNA,當機體內(nèi)包含自身雙鏈DNA的免疫復合物清除障礙時,會異常激活TLR9,觸發(fā)天然免疫系統(tǒng)對內(nèi)源性核酸產(chǎn)生過度的免疫應答反應,從而出現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)疾病。另外,前人研究報道全血細胞的TLR9表達與SLE患者C3相關,且應用TLR9激動劑治療時,患者出現(xiàn)血小板減少癥(thrombocytopenia,TCP)的風險增加,但是,關于TLR9如何參與SLE合并血小板減少癥(TCP-SLE)目前尚不清楚。因此,盡管SLE中關于TLR9的研究很多,但關于TLR9在SLE疾病中的作用、新的信號通路以及在TCP-SLE亞型中TLR9通過何種途徑參與疾病這些方面尚缺乏深入研究�？梢源_定的是,TLR9在自身免疫性疾病SLE中的扮演著關鍵性角色,深入研究TLR9的臨床價值及TLR9相關信號通路在系統(tǒng)性紅斑狼瘡及其亞型中的作用機制是一項具有深刻意義的研究課題。目的:檢驗TLR9相關信號通路TLR9/TGF-β1/PDGF-B在SLE患者和TLR9/TGF-β1/C3在TCP-SLE中的表達情況,深入探討TLR9的表達水平在SLE患者中的臨床價值,尤其是TLR9與SLE患者2年內(nèi)的預后相關性。方法:在臨床觀察性研究中,選取初診的SLE患者(n=112)及其亞型TCP-SLE患者(n=38),同時選取年齡、性別匹配的健康對照,詳細記錄臨床疾病活動性指標、血液學、生化等指標,應用q RT-PCR方法檢測全血細胞的TLR9、TGF-β1、PDGF-B和C3等基因的m RNA表達水平,應用ELISA方法檢測TLR9、TGF-β1、PDGF-B等因子的血漿蛋白水平,并跟蹤隨訪SLE患者,記錄疾病活動性情況及SLE患者2年內(nèi)的預后情況。結(jié)果:1.SLE患者外周血中TLR9、TGF-β1和PDGF-B的水平高于正常人:SLE患者外周血細胞中TLR9的m RNA水平顯著高于健康對照組(p=0.0048),血漿中TGFβ1和PDGF-B蛋白水平明顯高于健康對照組(p0.0001和p=0.0084)。經(jīng)過免疫調(diào)節(jié)治療后,隨著SLE患者的疾病活動度評分SLEDAI明顯下降,治療后的TGF-β1和PDGF-B m RNA水平較治療前也明顯下降(p0.0001和p=0.0255)。2.正常人與SLE患者中TLR9、TGF-β1和PDGF-B三者彼此間均顯著相關:健康人外周血中PDGF-B的蛋白水平與TGF-β1蛋白水平相關(p0.0001,r=0.61),SLE患者外周血中PDGF-B的蛋白水平與TGF-β1蛋白水平也具有明顯的相關性(p0.0001,r=0.68);同時,在健康人和SLE患者中TGF-β1 m RNA水平均與PDGF-B m RNA水平正相關(健康人,p=0.0268,r=0.33;SLE患者p0.0001,r=0.61);而且,在健康人中TLR9和TGF-β1的m RNA水平具有顯著正相關性(p=0.0003,r=0.51),TLR9和PDGFB的m RNA水平也具有顯著正相關性(p=0.0018,r=0.45);同樣,在SLE患者中也存在相似的情況,TLR9和TGF-β1的m RNA水平具有顯著正相關性(p0.0001,r=0.52),TLR9和PDGF-B的m RNA水平也具有顯著正相關性(p0.0001,r=0.45)。3.升高的TLR9 m RNA水平與這些升高的MCP-1、ISG15和IFNα的m RNA之間并不存在相關性:我們檢測TLR9 m RNA的表達是否與其他已知的因子相關或者存在網(wǎng)絡通路。初診的活動期SLE患者中,MCP-1、ISG15和IFNα的m RNA水平顯著高于正常人(MCP-1,p=0.0039;ISG15,p=0.0004;IFNα,p=0.0073)。然而,我們的結(jié)果顯示升高的TLR9 m RNA水平與這些升高的MCP-1、ISG15和IFNα的m RNA之間并不存在相關性(TLR9與MCP-1,p=0.2544,r=0.1091;TLR9與ISG15,p=0.9722,r=-0.0072;TLR9與IFNα,p=0.1247,r=-0.3549)。4.TLR9激活后能刺激TGF-β1和PDGF-B的m RNA表達水平升高:在正常人(TGF-β1,p=0.0210;PDGF-B,p=0.0093)與SLE患者(TGF-β1,p=0.0005;PDGF-B,p=0.0005)中,Cp G均可以顯著上調(diào)TGF-β1和PDGFB的m RNA表達。但是,Cp G對于SLE患者的全血細胞誘導產(chǎn)生的TGF-β1m RNA顯著多于Cp G對于健康人全血細胞誘導產(chǎn)生的TGF-β1 m RNA(p=0.0485),同時,Cp G對于PDGF-B的誘導也存在同樣的現(xiàn)象(p=0.0037)。而對于CD14+的單核細胞,我們體外培養(yǎng)并給予Cp G刺激后也發(fā)現(xiàn)存在同樣的現(xiàn)象,即,Cp G刺激SLE患者CD14+單核細胞產(chǎn)生的TGF-β1和PDGFB m RNA均顯著高于健康人。5.TGF-β1能夠誘導PDGF-B產(chǎn)生:在全血細胞培養(yǎng)體系中加入了重組人TGF-β1蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組人TGF-β1蛋白能夠顯著增加PDGF-B的m RNA(p=0.0156,)和蛋白水平(p=0.0020);相反,我們在培養(yǎng)體系中加入TGF-β1拮抗劑,則可以顯著抑制PDGF-B的m RNA(p0.05)和蛋白表達(p0.05)。6.PDGF-B能夠刺激腎小球系膜細胞增殖:SLE患者原代血細胞經(jīng)過Cp G刺激培養(yǎng)后的上清液能夠顯著誘導系膜細胞增殖(p=0.0171)。另外,SLE患者的血漿對于系膜細胞的誘導增殖程度明顯高于健康人血漿(p=0.0116)。同時,應用抗PDGF-B中和抗體能夠抑制SLE患者血漿誘導的系膜細胞增殖,并且這種抑制是呈劑量依賴性的(p0.05)。7.PDGF-B與SLE患者并發(fā)狼瘡腎炎(lupus nepheritis,LN)有關:在m RNA水平發(fā)現(xiàn)LN患者全血細胞中TGF-β1與PDGF-B正相關(p=0.0092,r=0.61),TLR9與TGF-β1正相關(p=0.0003,r=0.51),TLR9與PDGFB正相關(p=0.0052,r=0.44)。而且,這些LN患者的血漿中TGF-β1和PDGF-B蛋白水平也呈正相關((p0.0001,r=0.64)。另外,PDGF-B血漿蛋白水平與尿蛋白定量顯著相關(p0.0027,r=0.49)。8.合并TCP的SLE患者全血細胞中C3、TLR9和TGF-β1基因表達增加:TCPSLE患者的血漿C3水平顯著低于非TCP-SLE患者的水平(p=0.005)。相反,C3 m RNA表達的水平卻顯著升高(p0.01)。此外,TCP-SLE患者全血細胞的TLR9和TGF-β1m RNA表達水平也顯著高于非TCP-SLE患者(TLR9和TGF-β1的p0.05)。9.TCP-SLE患者的臨床指標與TLR9、TGF-β1和C3的相關性:TCP-SLE患者TLR9 m RNA在高滴度抗ds DNA抗體組的水平顯著高于低滴度抗ds DNA抗體組中的水平(p0.05)。此外,血漿C3的水平與SLEDAI評分和抗ds DNA抗體的滴度負相關(SLEDAI的r=-0.33,p=0.0411;抗ds DNA抗體滴度的r=-0.37,p=0.0207)。血漿C3水平與全血細胞中C3 m RNA的相對水平負相關(r=-0.41,p=0.0113),但與TCP-SLE患者的血小板計數(shù)呈正相關(r=0.37,p=0.0211)。此外,TCP-SLE患者全血細胞中在m RNA水平TGF-β1與TLR9正相關(r=0.62,p0.0001)和C3正相關(r=0.45,p=0.0043)。10.經(jīng)過免疫調(diào)節(jié)治療后,緩解的患者全血細胞中TLR9、TGF-β1和C3 m RNA的水平顯著低于治療前的基線水平(均p0.05)。11.應用Cp G刺激共培養(yǎng)的TCP-SLE患者全血細胞中TGF-β1的基因和蛋白水平均顯著增加。應用TGF-β1刺激可以顯著增加C3的基因和蛋白表達,而應用SB431542(TGF-βRI/ALK抑制劑)刺激則顯著降低C3的基因和蛋白表達。此外,應用Cp G激活TLR9后也顯著增加了全血細胞中C3表達的水平,并且可以通過SB431542的共培養(yǎng)完全抑制TLR9上調(diào)C3的效應。12.我們的臨床隊列研究發(fā)現(xiàn),SLE患者的全血細胞中TLR9 m RNA水平明顯升高,并且在SLEDAI亞組、抗ds DNA抗體亞組和C3亞組中存在顯著差異,但在腎受累亞組中無差異。13.高水平TLR9 m RNA與SLE不良預后獨立相關:在2年隨訪期間,52例(57.8%)患者出現(xiàn)臨床緩解并一直持續(xù)良好,其余38例(42.2%)分別在不同時間出現(xiàn)不良預后。單因素分析顯示基線時24小時尿蛋白定量0.5g(HR,3.81;95%CI,1.96-7.40),低血清C3水平(HR,0.31;95%CI,0.09-0.98),SLEDAI水平(HR,1.05;95%CI,1.02-1.09),C-反應蛋白水平(HR,1.006;95%CI,1.001-1.012)和高TLR9 m RNA水平(HR,3.60;95%CI,1.88-6.89)均預示著2年隨訪期內(nèi)可能出現(xiàn)不良預后。多變量分析調(diào)整后,持續(xù)性蛋白尿(0.5g/天;HR,6.31;95%CI,2.86-13.95),C-反應蛋白(HR,1.013;95%CI,1.007-1.019)和高TLR9m RNA水平(HR,3.85;95%CI,1.93-7.68)是預后不良的獨立危險因素,而應用多于一種免疫抑制劑治療(HR,0.37;95%CI,0.17-0.81)則是良好預后的保護性因素。14.SLE患者基線(初次診斷時)TLR-9 m RNA水平升高組發(fā)生不良預后的中位時間為診斷后6個月(范圍,0-13.83個月)。Kaplan-Meier生存曲線表明,低-TLR9組SLE患者治療2年時出現(xiàn)預后良好的概率為66%(95%CI,54.2-77.8),而高-TLR9組SLE患者治療2年時出現(xiàn)預后良好的概率為30%(95%CI,10.4-49.6),SLE患者初診基線高-TLR9 m RNA水平組出現(xiàn)預后不良的概率是基線低-TLR9 m RNA組的3.85倍(HR,3.85;95%CI,1.93-7.68;P=0.000)。15.預后不良的SLE患者2年后TLR9 m RNA仍保持較高水平:不良預后組的基線TLR9 m RNA水平顯著高于預后良好組(P0.0001)。與基線水平相比,2年后預后良好組TLR9 m RNA水平顯著降低(P0.0001),但預后不良組(P=0.1192)中TLR9 m RNA水平仍然較高。結(jié)論:1.人類外周血細胞中存在TLR9/TGF-β/PDGF-B通路,并且在SLE患者的外周血中過度激活。且該途徑參與腎小球腎炎發(fā)病機制,這有助于臨床理解LN的病理過程,并由此可以研發(fā)TLR9、TGF-β或PDGF-B拮抗劑,以早期預防、控制腎小球纖維化和LN的腎功能惡化。2.外周血細胞是TCP-SLE患者C3的肝外合成來源,并且外周血C3的肝外合成能夠被TLR9通過誘導TGF-β1上調(diào)。TLR9/TGF-β1/C3途徑有可能參與SLE患者中血小板減少的病理過程,但尚需要進一步深入的研究。3.隊列研究表明TLR9參與SLE發(fā)病機制,與疾病活動相關,并且可能預測2年內(nèi)的SLE預后結(jié)局。這表明在SLE初次診斷時的TLR9 m RNA明顯升高的患者短期內(nèi)可能會出現(xiàn)不良預后,有助于提示臨床醫(yī)生加強對這類患者進行更頻繁的臨床監(jiān)測。TLR9可能會成為一個用于預測SLE預后的非常有用的生物標志物。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R593.241

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本文編號：1418230