本文關(guān)鍵詞：sigma-1受體缺失對多巴胺神經(jīng)元的影響及其機制研究　出處：《南京醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：sigma-1受體(σ_1R)是含有223個氨基酸殘基的G蛋白偶聯(lián)受體,在海馬錐體神經(jīng)元、黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞選擇性高表達。胞膜σ_1R激活能促進N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的鈣離子內(nèi)流,增加谷氨酸和多巴胺的釋放。定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的σiR參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體的鈣信號傳遞和鈣平衡的維持。帕金森病(Parkinson's disease,PD)是以靜止性震顫、隨意運動遲緩等運動協(xié)調(diào)障礙為臨床癥狀的神經(jīng)退行性疾病。PD的主要病理特征是黑質(zhì)致密部(Substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺神經(jīng)元丟失和Lewy小體形成。σ_1R密度在PD患者黑質(zhì)-紋狀體區(qū)域低于正常人。σ_1R基因敲除(σ_1R-/-)小鼠出現(xiàn)年齡相關(guān)的運動功能損害。雖然σ_1R-/-小鼠發(fā)生脊髓αα運動神經(jīng)元死亡,但是σ_1R缺失是否影響黑質(zhì)的多巴胺神經(jīng)元迄今還未見有報道。α-synuclein(αSyn)的聚集體和纖維化是Lewy小體形成的主要病理機制。阻斷σ_1R通過擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體間的鈣平衡,誘導(dǎo)蛋白酶體活性降低和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以促進αSyn的聚集體和磷酸化。此外,σ_1R活化能減少細胞膜脂筏中神經(jīng)節(jié)苷脂GM1組分。GM1與αSyn結(jié)合能促進αSyn的聚集體和纖維化形成。以上研究報道提示,σ_1R缺失可能會影響多巴胺神經(jīng)元的αSyn聚集和磷酸化。因為αSyn聚集、纖維化和磷酸化都有一定的細胞毒性,是PD腦多巴胺神經(jīng)元丟失的重要病理機制。因此,本課題將研究σ_1R-/-小鼠的運動協(xié)調(diào)障礙是否與黑質(zhì)區(qū)αSyn聚集體形成和磷酸化,及其造成的多巴胺神經(jīng)元損害有關(guān)。星形膠質(zhì)細胞表達σ_1R。PD腦有大量活化的星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)炎性因子水平的增加。神經(jīng)毒素MPTP或6-羥基多巴引起多巴胺神經(jīng)元死亡,同時也刺激星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活化,提示多巴胺神經(jīng)元損傷的炎癥病理機制。有研究報道,甲基苯丙胺處理星形膠質(zhì)細胞可通過活化σ_1R能提高ERK1/2磷酸化和CREB轉(zhuǎn)錄水平,進而促進GFAP的表達。此外,甲基苯丙胺通過上調(diào)多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)、囊泡單胺轉(zhuǎn)運蛋白2(VMAT2)或NMDA受體鈣離子內(nèi)流,促進多巴胺釋放,發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。阻斷σ_1R能抑制NMDA受體NR2B磷酸化,減少NMDA受體的鈣離子內(nèi)流。但是,PD腦σ_1R減少是否與黑質(zhì)的多巴胺神經(jīng)元丟失有關(guān)迄今沒有報道。研究目的1.明確σ_1R對多巴胺神經(jīng)元的影響及其分子機制。2.探討σ_1R缺失對MPTP誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的作用及其調(diào)控機制。第一部分σ_1R對多巴胺神經(jīng)元的影響及其分子機制材料與方法1.用PCR方法鑒定σ_1R-/-小鼠。本研究使用3月齡、6月齡和9月齡的雄性σ_1R-/-小鼠和同窩野生型(WT)小鼠。2.用勻速和加速轉(zhuǎn)棒實驗檢測小鼠的運動協(xié)調(diào)和平衡功能。3.用σ_1R和TH免疫組織染色,Hochest染色。SNpc的TH陽性(TH+)細胞和Hochest陽性(Hochest+)細胞計數(shù)。4.用免疫印記方法檢測黑質(zhì)區(qū)σσ_1R、可溶性及不可溶性的αSyn、磷酸化αSyn、磷酸化 eIF2a、CHOP。5.用熒光測定法分析黑質(zhì)區(qū)蛋白酶體活性。結(jié)果1.與同齡WT小鼠相比,6月齡和9月齡σ_1R-/-小鼠從勻速或加速轉(zhuǎn)棒上的掉落時間減少,而3月齡σ_1R-/-小鼠在轉(zhuǎn)棒上的停留時間沒有明顯差異——σ_1R缺失引起年齡相關(guān)的運動協(xié)調(diào)功能減退。2.WT小鼠SNpc多巴胺神經(jīng)元表達σ_1R。與同齡WT小鼠相比,6月齡和9月齡σ_1R-/-小鼠SNpc的TH+細胞數(shù)目減少和Hochest+細胞增多,而3月齡σ_1R-/-小鼠TH+細胞和Hochest+細胞數(shù)目沒有明顯改變——σ_1R缺失引起年齡相關(guān)的多巴胺神經(jīng)元死亡。3.6月齡和9月齡σ_1R-/-小鼠黑質(zhì)不可溶αSyn聚集體(70-100 kD)水平明顯增高,但是可溶αSyn單體(14 kD)沒有明顯變化。9月齡σ_1R-/-小鼠SNpc的多巴胺神經(jīng)元中αSyn纖維化水平明顯增加——σ_1R缺失引起年齡相關(guān)的αSyn聚集和纖維化。4.6月齡和9月齡σ11R-/-小鼠黑質(zhì)的αSyn單體(14 kD)和聚集體(100 kD)磷酸化水平明顯增加,伴有蛋白酶體活性的降低—σ_1R缺失增強αSyn磷酸化,降低蛋白酶體活性。5.與WT小鼠相比,6月齡和9月齡σ_1R-/-小鼠黑質(zhì)的磷酸化eIF2a和CHOP蛋白水平明顯增加,而3月齡σ_1R-/-小鼠沒有明顯改變——σ_1R缺失引起黑質(zhì)神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。6.在5月齡或8月齡σ_1R-/-鼠,GM1結(jié)合劑利福平(Rif)處理(30天)能部分減少αSyn聚集,但不影響αSyn磷酸化和蛋白酶體活性。在5月齡σ_1R-/-小鼠,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑salubrinal處理(30天)能抑制αSyn聚集和磷酸化,并提高蛋白酶體活性。在8月齡σ_1R-/-小鼠,salubrinal處理能抑制αSyn磷酸化,但是對αSyn聚集沒有明顯作用——σ_1R缺失→內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激→降低蛋白酶體活性→增加αSyn磷酸化→促進αSyn聚集;σ_1R缺失→增加脂筏GM1組分→易化αSyn聚集和纖維化。7.在5月齡或8月齡σ_1R-/-鼠,salubrinal處理(30天)能減少多巴胺神經(jīng)元丟失,并緩解運動協(xié)調(diào)功能障礙。在8月齡σ_1R-/-小鼠,Rif處理(30天)能部分阻止多巴胺神經(jīng)元丟失和運動協(xié)調(diào)功能損害——σ_1R缺失通過增加αSyn聚集和磷酸化引起多巴胺神經(jīng)元毒性。小結(jié)σ_1R缺失引起年齡相關(guān)的αSyn聚集和磷酸化增加,引起進行性多巴胺神經(jīng)元死亡,導(dǎo)致運動協(xié)調(diào)和平衡功能障礙(小結(jié)圖)。第二部分σ_1R缺失對MPTP誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的作用及其調(diào)控機制材料與方法1.用PCR方法鑒定σ_1R基因敲除雜合子(σ_1R+/-)和純合子(σ_1R-/-)小鼠。第一部分的研究已確定3月齡σ_1R-/-小鼠沒有發(fā)生運動協(xié)調(diào)障礙、多巴胺神經(jīng)元死亡、αSyn聚集和磷酸化,因此第二部分研究將采用3月齡σ_1R+/-小鼠和σ_1R-/-小鼠。2.整體試驗:MPTP(20 mg/kg)連續(xù)5周進行皮下注射制備PD模型。離體試驗:MPP+(500 μM)處理原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞。3.行為學檢測:用平衡木實驗和轉(zhuǎn)棒實驗評價運動平衡和協(xié)調(diào)功能。4.TH、GFAP、Iba1免疫組織染色和Hochest染色。進行SNpc的TH+細胞、Hochest+細胞、GFAP+細胞和Iba1+細胞計數(shù)。5.用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測黑質(zhì)和培養(yǎng)細胞上清IL-6、IL-1β、TNF-α水平。6.用蛋白免疫印記方法檢測小鼠黑質(zhì)腦區(qū)或培養(yǎng)細胞的DAT、VAMT2、GFAP、Iba1蛋白水平,ERK1/2和NR2B磷酸化水平。結(jié)果1.在MPTP末次給藥的第5天后,MPTP處理的WT小鼠(MPTP小鼠)穿越平衡木時間比WT小鼠延長,從轉(zhuǎn)棒上掉落時間明顯縮短。與WT小鼠或σ_1R-/-小鼠相比,MPTP處理的σ_1R-/-小鼠(MPTP-σ_1R-/-小鼠)或σ_1R+/-小鼠(MPTP-σ_1R+/-小鼠)無論穿越平衡木的時間或者轉(zhuǎn)棒的掉落時間并沒有顯著差異。用σ_1R阻斷劑NE100連續(xù)6周處理能改善MPTP小鼠的運動協(xié)調(diào)和平衡功能。用σ_1R激動劑PRE084處理能使得MPTP-σ_1R+/-小鼠發(fā)生運動協(xié)調(diào)和平衡障礙——σ_1R缺失可以緩解MPTP引起的運動協(xié)調(diào)和平衡障礙。2.與WT小鼠相比,MPTP小鼠SNpc的TH+細胞減少和Hochest+細胞增多,但是MPTP-σ_1R-/-小鼠沒有發(fā)生SNpc的TH+細胞減少和Hochest+細胞增加。與運動行為的結(jié)果相似,σ_1R阻斷劑NE100能阻止MPTP小鼠TH+細胞減少,σiR激動劑PRE084引起MPTP-σ_1R+/-鼠發(fā)生TH+細胞丟失——σ_1R缺失對MPTP引起多巴胺神經(jīng)元死亡有拮抗作用。3.WT小鼠SNpc的GFAP+4細胞表達σ_1R,而Iba1+細胞不表達。與WT小鼠相比,σ_1R-/-小鼠GFAP+細胞和Iba1+細胞形態(tài)和數(shù)量都沒有明顯的變化。與WT小鼠相比,MPTP小鼠和MPTP-σ_1R-/-小鼠SNpc的Iba1+細胞均增加大約30-40%。在MPTP小鼠,GFAP+細胞顯示突起數(shù)量增多和變粗,細胞數(shù)量比WT小鼠增加2倍以上。在MPTP-σ_1R-/-小鼠,GFAP+細胞僅增加了 20%。σσiR阻斷劑NE100能阻止MPTP-小鼠GFAP+細胞增加——σ_1R缺失能抑制MPTP刺激星形膠質(zhì)細胞活化。4.在體外星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞試驗中,MPP+處理能增加星形膠質(zhì)細胞GFAP表達和小膠質(zhì)細胞的Iba1表達。MPP+處理星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞培育液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α濃度也都明顯增加。NE100能阻止MPP+促進星形膠質(zhì)細胞的GFAP表達和釋放炎性因子,但是對MPP+增加小膠質(zhì)細胞的Iba1表達和炎性因子釋放沒有作用——阻斷σ_1R能抑制MPP+刺激星形膠質(zhì)細胞活化。5.在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞,NE100處理能阻止MPP+增加ERK1/2的磷酸化水平。MEK抑制劑U0126能顯著地抑制MPP+促進IL-6、IL-1β、TNF-α釋放。在培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞,NE100不影響MPP+增加ERK1/2的磷酸化。NE100和U0126對MPP+促進Iba1表達和IL-6、IL-1β、TNF-α釋放沒有明顯的作用。6.與WT小鼠相比,σ_1R-/-小鼠黑質(zhì)的NR2B磷酸化水平明顯減少,MPTP小鼠NR2B磷酸化水平增加,MPTP-σ_1R-/-小鼠NR2B磷酸化水平增加不明顯。NMDA受體激動劑NMDA能引起MPTP-σ_1R-/-小鼠TH+細胞缺失,而NR2B阻斷劑Rσ25-6981能減少MPTP小鼠的TH+細胞缺失——σ_1R缺失通過降低黑質(zhì)區(qū)NR2B磷酸化水平,阻止MPTP誘導(dǎo)神經(jīng)細胞死亡。。7.與WT小鼠相比,σ_1R-/-小鼠黑質(zhì)的DAT表達水平降低。NMDA能提高σ_1R-/-小鼠黑質(zhì)的DAT表達。MPTP小鼠DAT表達明顯減少。MPTP-σnR-/-小鼠DAT表達水平與σ_1R-/-小鼠相比沒有明顯的差異——σ_1R缺失引起DAT低表達能減少神經(jīng)細胞內(nèi)MPP+,以阻止MPTP誘導(dǎo)神經(jīng)細胞死亡。8.與WT小鼠相比,σ_1R-/-小鼠黑質(zhì)的VMAT2表達水平?jīng)]有改變。NE100能阻止MPTP-WT小鼠的VMAT2蛋白水平明顯降低,提示多巴胺神經(jīng)細胞死亡導(dǎo)致VMAT2減少。小結(jié)σ_1R缺失通過抑制MPTP刺激星形膠質(zhì)細胞活化或DAT表達,減少多巴胺神經(jīng)元死亡和運動功能損傷(小結(jié)圖)�？偨Y(jié)和臨床意義本研究的結(jié)果提示在PD患者早期黑質(zhì)-紋狀體σ_1R的減少或功能降低通過抑制神經(jīng)炎癥和神經(jīng)興奮毒性能減少多巴胺神經(jīng)元死亡,而在PD患者中晚期σ_1R減少能促進αSyn聚集和磷酸化,增加多巴胺神經(jīng)元死亡。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R742.5

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本文編號：1403583