發(fā)布時間：2018-01-01 03:26

  本文關鍵詞：HDAC抑制劑LMK-235對DPCs成牙本質細胞向分化的作用及機制的研究　出處：《南方醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 牙髓細胞 組蛋白去乙�；敢种苿� 組蛋白修飾 成牙本質向分化

【摘要】：研究背景牙髓細胞(dental pulp cells,DPCs)具有一定的多向分化潛能,可分化為成牙本質樣細胞,故成為牙髓及牙體硬組織再生的焦點。組蛋白修飾在干細胞分化中的作用受到越來越多的關注。組蛋白乙�；笫笵NA更容易與轉錄因子啟動子區(qū)域相結合,促進基因轉錄。組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase,HAT)和組蛋白去乙�；�(histone deacetylase,HDAC)共同控制染色質各區(qū)域核心組蛋白的乙酰化程度。LMK-235為HDAC4、5特異性抑制劑,本實驗使用LMK-235體外作用于DPCs,探討其在DPCs成牙本質細胞向分化中的作用及可能的機制。研究內容第一章DPCs的體外分離、培養(yǎng)和鑒定一.方法1.DPCs的分離培養(yǎng):酶組織塊消化法分離培養(yǎng)細胞;2.DPCs的干細胞特性的鑒定:①MTT法檢測細胞增殖,②流式細胞儀檢測表面標記物(CD29、CD44、CD90、CD45、CD31和CD34),③對細胞行成骨、成脂、成軟骨誘導,21天后分別進行茜素紅、尼羅紅、阿利新藍染色。二.結果1.DPCs呈長梭形貼壁生長,增殖迅速;2.細胞表面標記物的檢測:流式細胞儀檢測CD29、CD44、和CD90表達呈(+),CD45、CD31 和 CD34 表達呈(-);3.多向分化能力檢測:細胞經礦化誘導后茜素紅染色可見礦化結節(jié),經成脂誘導后尼羅紅染色可見脂滴,成軟骨誘導后阿利新藍染色可見藍染。第二章LMK-235對DPCs生物學特性的影響一.方法1.細胞增殖水平的檢測:MTT法檢測不同濃度LMK-235(0、50、100、250、500及1000nM)對DPCs增殖的影響;2.成牙本質分化相關因子的檢測:qRT-PCR檢測ALP、Runx2、DSPPmRNA;3.HDAC4、HDAC5 蛋白檢測:Western blot檢測 OnM及100nM組細胞HDAC4、HDAC5蛋白表達。二.結果1.LMK-235對細胞增殖的影響:高濃度LMK-235對細胞增殖有抑制作用,低濃度時則無明顯影響;2.低濃度LMK-235對ALP、Runx2、DSPP mRNA表達具有促進作用,且在100nM時作用最為明顯;3.100nM LMK-235可明顯抑制DPCs中HDAC4蛋白表達。第三章 LMK-235對DPCs成牙本質細胞向分化的作用一 ·方法1.細胞分組:對照組、LMK-235組、MI組及MI+LMK-235組;2.成牙本質分化相關因子的檢測:細胞培養(yǎng)7天時檢測ALP活性,第21天時茜素紅染色檢測礦化結節(jié)形成情況,第7、14、21天,qRT-PCR檢測ALP、DSPP、Runx2、OCN 基因表達;Western blot 檢測 DSPP、Runx2 蛋白表達。二.結果1.LMK-235可升高DPCs中ALP活性并促進礦化結節(jié)的形成;2.LMK-235可促進DPCs中成牙本質相關因子mRNA及蛋白的表達,且在細胞分化早期作用更為明顯。第四章LMK-235調控DPCs成牙本質分化的作用機制第一部分DSPP啟動子區(qū)域組蛋白乙�；贚MK-235調控DPCs成牙本質細胞向分化中的作用一.方法1.細胞分組..對照組、LMK-235組、MI組及MI+LMK-235組。2.Western blot檢測組蛋白H3、H4、乙�；M蛋白H3、H4蛋白表達情況;3.染色質免疫共沉淀:檢測細胞內H3K27Ac與DSPP啟動子區(qū)域結合情況。二.結果1.LMK-235及礦化誘導的應用可促進DPCs內組蛋白H3乙�；�;2.MI+LMK-235組H3K27Ac與DSPP啟動子區(qū)域結合高于MI組。第二部分VEGF/AKT參與LMK-235介導的DPCs成牙本質細胞向分化一.方法1.將細胞分為4組:對照組、LMK-235組、MI組及MI+LMK-235組。第7、14、21 天后 qRT-PCR 檢測 VEGF、AKT、mTOR mRNA 的表達,Western blot檢測AKT、p-AKT蛋白表達情況。2.使用AKT通路抑制劑Wortmannin,將細胞分為三組:MI組、MI+LMK-235組及MI+LMK-235+Wortmannin組。ALP染色檢測ALP活性,茜素紅染色檢測礦化結節(jié)形成情況,qRT-PCR及Western blot檢測ALP、DSPP、Runx2的表達。二.結果1.LMK-235在DPCs分化過程中可使VEGF、ATK mRNA及p-AKT蛋白的表達上調;2.Wortmannin可部分抑制LMK-235促進的ALP活性、礦化結節(jié)的形成及ALP、DSPP、Runx2基因及蛋白表達。結論1.組織塊酶消化法可成功分離培養(yǎng)出人牙髓細胞,細胞貼壁生長,增殖迅速,可表達干細胞表面標記物,具有多向分化潛能;2.100nM LMK-235可通過增加ALP活性、促進礦化結節(jié)的形成、促進成牙本質向分化相關因子的表達來誘導細胞分化;3.LMK-235可上調細胞內組蛋白H3乙酰化水平,通過促進H3K27Ac與DSPP啟動子區(qū)域結合調控DSPP表達及激活VEGF/AKT通路雙向作用促進DPCs成牙本質向分化。
[Abstract]:In vitro isolation , culture and identification of CD29 , CD44 , CD90 , CD31 and CD34 were studied by MTT assay . 2 . LMK - 235 can promote the expression of dentin - related factors mRNA and protein in DPCs , and the role of LMK - 235 in the differentiation of DPCs is regulated by LMK - 235 . The expression of VEGF , ATK mRNA and protein in DPCs was detected by Western blot . Results 1.LMK - 235 could increase the expression of VEGF , ATK mRNA and protein in DPCs . Conclusion 1 . LMK - 235 could increase the expression of ALP , DSPP , Runx2 . Conclusion 1 . LMK - 235 could regulate the expression of ALP , DSPP , Runx2 .

【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R781.3

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