本文關(guān)鍵詞：HDAC抑制劑LMK-235對(duì)DPCs成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化的作用及機(jī)制的研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景牙髓細(xì)胞(dental pulp cells,DPCs)具有一定的多向分化潛能,可分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞,故成為牙髓及牙體硬組織再生的焦點(diǎn)。組蛋白修飾在干細(xì)胞分化中的作用受到越來越多的關(guān)注。組蛋白乙�；笫笵NA更容易與轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合,促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT)和組蛋白去乙�；�(histone deacetylase,HDAC)共同控制染色質(zhì)各區(qū)域核心組蛋白的乙酰化程度。LMK-235為HDAC4、5特異性抑制劑,本實(shí)驗(yàn)使用LMK-235體外作用于DPCs,探討其在DPCs成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化中的作用及可能的機(jī)制。研究?jī)?nèi)容第一章DPCs的體外分離、培養(yǎng)和鑒定一.方法1.DPCs的分離培養(yǎng):酶組織塊消化法分離培養(yǎng)細(xì)胞;2.DPCs的干細(xì)胞特性的鑒定:①M(fèi)TT法檢測(cè)細(xì)胞增殖,②流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)記物(CD29、CD44、CD90、CD45、CD31和CD34),③對(duì)細(xì)胞行成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo),21天后分別進(jìn)行茜素紅、尼羅紅、阿利新藍(lán)染色。二.結(jié)果1.DPCs呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng),增殖迅速;2.細(xì)胞表面標(biāo)記物的檢測(cè):流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29、CD44、和CD90表達(dá)呈(+),CD45、CD31 和 CD34 表達(dá)呈(-);3.多向分化能力檢測(cè):細(xì)胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)后茜素紅染色可見礦化結(jié)節(jié),經(jīng)成脂誘導(dǎo)后尼羅紅染色可見脂滴,成軟骨誘導(dǎo)后阿利新藍(lán)染色可見藍(lán)染。第二章LMK-235對(duì)DPCs生物學(xué)特性的影響一.方法1.細(xì)胞增殖水平的檢測(cè):MTT法檢測(cè)不同濃度LMK-235(0、50、100、250、500及1000nM)對(duì)DPCs增殖的影響;2.成牙本質(zhì)分化相關(guān)因子的檢測(cè):qRT-PCR檢測(cè)ALP、Runx2、DSPPmRNA;3.HDAC4、HDAC5 蛋白檢測(cè):Western blot檢測(cè) OnM及100nM組細(xì)胞HDAC4、HDAC5蛋白表達(dá)。二.結(jié)果1.LMK-235對(duì)細(xì)胞增殖的影響:高濃度LMK-235對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用,低濃度時(shí)則無明顯影響;2.低濃度LMK-235對(duì)ALP、Runx2、DSPP mRNA表達(dá)具有促進(jìn)作用,且在100nM時(shí)作用最為明顯;3.100nM LMK-235可明顯抑制DPCs中HDAC4蛋白表達(dá)。第三章 LMK-235對(duì)DPCs成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化的作用一 ·方法1.細(xì)胞分組:對(duì)照組、LMK-235組、MI組及MI+LMK-235組;2.成牙本質(zhì)分化相關(guān)因子的檢測(cè):細(xì)胞培養(yǎng)7天時(shí)檢測(cè)ALP活性,第21天時(shí)茜素紅染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)形成情況,第7、14、21天,qRT-PCR檢測(cè)ALP、DSPP、Runx2、OCN 基因表達(dá);Western blot 檢測(cè) DSPP、Runx2 蛋白表達(dá)。二.結(jié)果1.LMK-235可升高DPCs中ALP活性并促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成;2.LMK-235可促進(jìn)DPCs中成牙本質(zhì)相關(guān)因子mRNA及蛋白的表達(dá),且在細(xì)胞分化早期作用更為明顯。第四章LMK-235調(diào)控DPCs成牙本質(zhì)分化的作用機(jī)制第一部分DSPP啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白乙�；贚MK-235調(diào)控DPCs成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化中的作用一.方法1.細(xì)胞分組..對(duì)照組、LMK-235組、MI組及MI+LMK-235組。2.Western blot檢測(cè)組蛋白H3、H4、乙�；M蛋白H3、H4蛋白表達(dá)情況;3.染色質(zhì)免疫共沉淀:檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H3K27Ac與DSPP啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合情況。二.結(jié)果1.LMK-235及礦化誘導(dǎo)的應(yīng)用可促進(jìn)DPCs內(nèi)組蛋白H3乙�；�;2.MI+LMK-235組H3K27Ac與DSPP啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合高于MI組。第二部分VEGF/AKT參與LMK-235介導(dǎo)的DPCs成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化一.方法1.將細(xì)胞分為4組:對(duì)照組、LMK-235組、MI組及MI+LMK-235組。第7、14、21 天后 qRT-PCR 檢測(cè) VEGF、AKT、mTOR mRNA 的表達(dá),Western blot檢測(cè)AKT、p-AKT蛋白表達(dá)情況。2.使用AKT通路抑制劑Wortmannin,將細(xì)胞分為三組:MI組、MI+LMK-235組及MI+LMK-235+Wortmannin組。ALP染色檢測(cè)ALP活性,茜素紅染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)形成情況,qRT-PCR及Western blot檢測(cè)ALP、DSPP、Runx2的表達(dá)。二.結(jié)果1.LMK-235在DPCs分化過程中可使VEGF、ATK mRNA及p-AKT蛋白的表達(dá)上調(diào);2.Wortmannin可部分抑制LMK-235促進(jìn)的ALP活性、礦化結(jié)節(jié)的形成及ALP、DSPP、Runx2基因及蛋白表達(dá)。結(jié)論1.組織塊酶消化法可成功分離培養(yǎng)出人牙髓細(xì)胞,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),增殖迅速,可表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物,具有多向分化潛能;2.100nM LMK-235可通過增加ALP活性、促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成、促進(jìn)成牙本質(zhì)向分化相關(guān)因子的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞分化;3.LMK-235可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)組蛋白H3乙�；�,通過促進(jìn)H3K27Ac與DSPP啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合調(diào)控DSPP表達(dá)及激活VEGF/AKT通路雙向作用促進(jìn)DPCs成牙本質(zhì)向分化。
[Abstract]:In vitro isolation , culture and identification of CD29 , CD44 , CD90 , CD31 and CD34 were studied by MTT assay . 2 . LMK - 235 can promote the expression of dentin - related factors mRNA and protein in DPCs , and the role of LMK - 235 in the differentiation of DPCs is regulated by LMK - 235 . The expression of VEGF , ATK mRNA and protein in DPCs was detected by Western blot . Results 1.LMK - 235 could increase the expression of VEGF , ATK mRNA and protein in DPCs . Conclusion 1 . LMK - 235 could increase the expression of ALP , DSPP , Runx2 . Conclusion 1 . LMK - 235 could regulate the expression of ALP , DSPP , Runx2 .

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R781.3

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本文編號(hào)：1362739