本文關(guān)鍵詞：VEGF125-136小肽標(biāo)記CY5.5及釓劑體內(nèi)外靶向熒光及MRI實(shí)驗(yàn)研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的一、實(shí)驗(yàn)組VEGF125-136小肽QS及對(duì)照組隨機(jī)小肽QK合成。二、QS及QK小肽活性檢測(cè),為進(jìn)一步熒光及MRI靶向探針制備及靶向成像奠定前期基礎(chǔ)。三、cy5.5-QS及cy5.5-QK合成,為下一步靶向熒光成像奠定基礎(chǔ)。四、cy5.5-QS及cy5.5-QK體內(nèi)外熒光成像,觀察其對(duì)BEL-7402細(xì)胞靶向性。五、QS-Gd及QK-Gd合成,為進(jìn)一步MRI靶向成像奠定基礎(chǔ)。六、QS-Gd及QK-Gd體內(nèi)外MRI成像,觀察其對(duì)BEL-7402細(xì)胞靶向性。方法一、VEGF125-136小肽QS及隨機(jī)小肽QK合成固相合成微球小肽QS及QK。二、ELISA法檢測(cè)QS及QK小肽活性三、cy5.5-QS 及 cy5.5-QK 合成取實(shí)驗(yàn)組QS與對(duì)照組QK放入固相合成器中標(biāo)記A與B,氨基脫保護(hù)后加CY5.5-NHS、DIPEA反應(yīng)3小時(shí)。TFA切割、乙醚真空沉淀,HPLC純化、干燥、質(zhì)譜。四、cy5.5-QS及cy5.5-QK體內(nèi)外熒光成像1、BEL-7402細(xì)胞體外熒光靶向?qū)嶒?yàn)(1)免疫熒光成像制備BEL-7402細(xì)胞爬片,加入VEGFR-2熒光抗體,DAPI復(fù)染細(xì)胞核,共聚焦顯微鏡觀察VEGFR-2受體表達(dá)情況。(2)細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)制備BEL-7402細(xì)胞爬片,實(shí)驗(yàn)組加CY5.5-QS,對(duì)照組加CY5.5-QK,DAPI復(fù)染細(xì)胞核,共聚焦顯微鏡觀察各組細(xì)胞熒光成像異同。2、BEL-7402細(xì)胞體內(nèi)熒光靶向?qū)嶒?yàn)(1)荷瘤鼠模型制備(2)活體熒光成像實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組注射QS-CY5.5,對(duì)照組注射QK-Cy5.5,多時(shí)間點(diǎn)采集圖像,選感興趣區(qū)測(cè)量熒光強(qiáng)度。五、QS-Gd及QK-釓合成QS實(shí)驗(yàn)組與QK對(duì)照組氨基脫保護(hù)后加入DOTA-tris、HBTU、HOBT,DIPEA 500 ul,350轉(zhuǎn)/分,2小時(shí)。FA切割,乙醚沉淀,分別加入乙酸釓82mg,油相內(nèi)合成,50度,PH始終保持在6.5,24小時(shí)。離心收集上清,凍干,HPLC純化并質(zhì)譜分析。六、VEGF125-136-Gd體內(nèi)外MRI成像(1)QS-Gd及QK-Gd體外細(xì)胞MRI靶向?qū)嶒?yàn)BEL-7402細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組加入遞增濃度的QS-Gd,對(duì)照組加入等量QK-Gd,37.5℃培養(yǎng)箱內(nèi)6小時(shí)。PBS實(shí)驗(yàn)組清洗后各組細(xì)胞消化酶各1ml消化1-2分,吸入離心管內(nèi),每管1.5ml,加入2%瓊脂糖懸浮。3.0MRI掃描,ROI=2mm,測(cè)量計(jì)算SNR。(2)QS-Gd及QK-Gd體內(nèi)MRI靶向?qū)嶒?yàn)實(shí)驗(yàn)尾靜脈注射QS-Gd(0.2mmolGd/kg),對(duì)照組尾靜脈注射等量QK-Gd。多時(shí)間點(diǎn)掃描,ROI直徑約2.0mm,測(cè)量計(jì)算SNR。(3)BEL-7402 HE染色及VEGFR2免疫組化結(jié)果一、VEGF125-136小肽QS及隨機(jī)小肽QK合成實(shí)驗(yàn)組QS小肽分子量為1815.87,對(duì)照組QK小肽分子量1689.95,符合理論分子量,合成正確。二、ELISA法檢測(cè)QS及QK小肽活性QS小肽體外有很強(qiáng)結(jié)合VEGFR2受體能力。三、cy5.5-QS 及 cy5.5-QK 合成QS-Cy5.5經(jīng)質(zhì)譜儀分析分子量2193.16,QK-Cy5.5經(jīng)質(zhì)譜儀分析分子量2067.94,合成正確。四、cy5.5-QS及cy5.5-QK體內(nèi)外熒光成像1.免疫熒光實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)顯示BEL-7402細(xì)胞膜有較多綠色熒光物質(zhì)FITC-VEGFR2抗體。2.細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)CY5.5-QS實(shí)驗(yàn)組BEL-7402細(xì)胞膜膜及細(xì)胞核細(xì)胞膜融合圖像可見大量靶向紅色熒光物質(zhì)CY5.5-QS:CY5.5-QK對(duì)照組未見明顯紅色熒光標(biāo)記。3.體內(nèi)熒光實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組尾靜脈給藥CY5.5-QS,熒光信號(hào)迅速上升,5分鐘達(dá)第一峰值后開始下降,60分鐘信號(hào)再次上升,2小時(shí)信號(hào)達(dá)最大值,為第二靶向峰值,然后再次下降,4小時(shí)接近平掃。對(duì)照組尾靜脈給藥CY5.5-QK,熒光信號(hào)迅速上升,5分鐘達(dá)峰值,后迅速下降,未見信號(hào)再次上升。五、VEGF125-136-Gd及隨機(jī)小肽-釓合成實(shí)驗(yàn)組QS-Gd經(jīng)質(zhì)譜儀分析分子量為2133.795,馳預(yù)率1/T1 = 7.79 mM-1s-1。對(duì)照組QK-Gd經(jīng)質(zhì)譜儀分析分子量為2264.348,馳預(yù)率1/T1= 7.46 mM-1s-1.六、QS-Gd及QK-Gd體內(nèi)外MRI成像1.QS-Gd及QK-Gd體外細(xì)胞MRI靶向?qū)嶒?yàn)QS-Gd實(shí)驗(yàn)組強(qiáng)化明顯高于對(duì)照組QK-Gd,且隨加入靶向釓劑增多強(qiáng)化增強(qiáng),對(duì)照組QK-Gd未見明顯強(qiáng)化。2.QS-Gd及QK-Gd體內(nèi)MRI靶向?qū)嶒?yàn)實(shí)驗(yàn)組尾靜脈給藥QS-Gd(0.2 mmol Gd/kg),T1信號(hào)迅速上升,5分鐘達(dá)第一峰值后開始下降,60分鐘信號(hào)再次上升,2小時(shí)信號(hào)大最大值,然后再次下降,4小時(shí)接近平掃。對(duì)照組尾靜脈給藥QK-Gd,T1信號(hào)迅速上升,5分鐘達(dá)峰值,后迅速下降,未見信號(hào)再次上升。3.免疫組化實(shí)驗(yàn)BEL-7402細(xì)胞膜表面有豐富的VEGFR2受體表達(dá)。結(jié)論1.成功合成實(shí)驗(yàn)組QS小肽及對(duì)照組QK小肽。2.QS小肽體外有很強(qiáng)結(jié)合VEGFR2受體活性。3.成功合成 cy5.5-QS 及 cy5.5-QK,cy5.5-QS 純度為 99.65%,cy5.5-QK 純度為 70.25%。4.免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明BEL-7402細(xì)胞膜VEGFR2受體陽(yáng)性。體內(nèi)外細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)顯示cy5.5-QS可以BEL-7402細(xì)胞膜VEGFR2受體為靶點(diǎn)靶向熒光成像。5.成功構(gòu)建QS-Gd及QK-Gd,對(duì)比劑理化性質(zhì)符合體內(nèi)外T1增強(qiáng)需要。6.BEL-7402腋下腫瘤模型制作成功。體內(nèi)外MRI實(shí)驗(yàn)表明QS-Gd可以BEL-7402細(xì)胞膜VEGFR2受體為靶點(diǎn)靶向MRI成像。
[Abstract]:Objective : To study the targeting ability of QK and QS - Gd and cy5.5 - QK . In vitro fluorescence imaging of BEL - 7402 cells was carried out . ( 2 ) In vivo fluorescence imaging experiment group , QS - CY5.5 was injected into the experimental group . The results showed that the concentration of QS - Gd and QK - Gd in the control group were all kept at 6.5 and 24 hours . The molecular weight of QS - Gd and QK - Gd in the experimental group were measured by mass spectrometer . The results showed that the expression of VEGFR2 receptor in BEL - 7402 cell membrane was 99.65 % , cy5.5 - QS purity was 99.65 % , cy5.5 - QS purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % .

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R445.2

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1 尤曉光;VEGF125-136小肽標(biāo)記CY5.5及釓劑體內(nèi)外靶向熒光及MRI實(shí)驗(yàn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：1356354