本文關鍵詞：高爾基體蛋白ACBD3參與腸道病毒復制的機制研究　出處：《北京協和醫(yī)學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： EV71 3A ACBD3 PI4KB 病毒復制中心

【摘要】：腸道病毒71型(EV71)是引起嬰幼兒重癥手足口病的主要病原體,其感染可導致嚴重的神經性疾病,包括無菌性腦膜炎、腦干腦炎和神經性肺水腫等。近年來大規(guī)模發(fā)生的手足口病疫情,嚴重危害嬰幼兒、尤其是農村地區(qū)幼兒的身體健康,給公共衛(wèi)生的發(fā)展帶來巨大挑戰(zhàn)。EV71屬于小RNA科病毒,報道表明小RNA病毒科病毒利用宿主細胞的內膜系統(tǒng)進行自身基因組的復制。病毒感染導致細胞內膜系統(tǒng)發(fā)生改變,富集病毒復制所需因子,形成不同于細胞內膜的膜結構,包含不同的蛋白組分和脂質組分,即病毒復制中心。病毒利用復制中心的宿主因子和病毒自身蛋白完成復制。最初報道表明高爾基體蛋白GBF1和ARF1在病毒復制中發(fā)揮重要作用。近年來發(fā)現,ACBD3介導嵴病毒3A蛋白募集病毒復制重要蛋白PI4KB至病毒復制中心。多種腸道病毒的3A蛋白也可以與ACBD3相互作用,但這種相互作用在不同病毒復制中的作用和機制不同,如柯薩奇病毒和鼻病毒的3A可以與ACBD3結合,但ACBD3并不參與二者的復制。目前,有關ACBD3在腸道病毒復制中的作用仍存在爭議。我們前期通過酵母雙雜交發(fā)現EV71的3A蛋白能與ACBD3相互作用。因此,本課題圍繞ACBD3在EV71病毒復制中的作用和分子機制進行深入的研究,以期進一步闡明EV71的復制機制,發(fā)現潛在的抗病毒藥物靶標,為病毒致病機理和抗病毒藥物的設計研發(fā)提供理論依據。通過外源性共轉染3A和ACBD3蛋白,驗證了 ACBD3和3A的相互作用。進一步發(fā)現病毒感染后,EV71 3A也可以與內源性ACBD3共定位,并影響ACBD3在細胞內的分布。利用RNAi敲低ACBD3的表達,或是利用CRISPR/Cas9技術敲除ACBD3的表達后EV71病毒基因組的復制、蛋白的翻譯及空斑形成能力均受到了抑制。而當回復ACBD3的表達后,病毒基因組的復制、蛋白的翻譯及空斑形成能力又可以得到拯救。通過突變和免疫共沉淀定位了 ACBD3與3A相互作用的關鍵區(qū)域,發(fā)現ACBD3的C端在其與3A結合中起著關鍵作用,而3A的41-86AA在其與ACBD3結合中十分重要。同時我們通過點突變發(fā)現EV71 3A的第44位異亮氨酸和第54位的組氨酸是二者相互作用中的關鍵位點。以上結果說明,ACBD3通過與EV71的3A蛋白結合參與病毒復制。此外,參與EV71復制的另外一個重要分子是PI4KB,但在EV71復制中如何募集至復制中心還不是十分清楚。我們首先驗證了 PI4KB是否參與EV71復制,發(fā)現PI4KB的抑制劑能抑制EV71病毒的復制,同時,利用RNAi技術敲低PI4KB的表達或是利用CRISPR/Cas9技術敲除PI4KB的表達后EV71病毒基因組的復制、蛋白的翻譯及空斑形成能力均受到了抑制。進一步研究PI4KB募集至復制中心的機制,發(fā)現EV71 3A能夠增強PI4KB與ACBD3間的相互作用,并且感染后三者均定位于病毒的復制中心,同時,EV71病毒感染細胞后能導致復制中心附近PI4P的量的增加,而這些過程均需要ACBD3的參與。分子篩層析實驗發(fā)現,在EV71病毒感染細胞后,會形成一個含有ACBD3,PI4KB,EV71-3A及EV71-3D的大分子復合物。EV71-3A第44位及第54位氨基酸的突變同樣會抑制ACBD3與PI4KB的結合。最后,我們發(fā)現ACBD3同樣參與到EV68病毒的復制過程中,而對HRV16病毒的復制不起作用。上述實驗結果說明,PI4KB參與EV71病毒的復制,并通過形成3A-ACBD3-PI4KB分子復合物的形式促進EV71及EV68病毒的復制,而HRV16的復制機制還需后續(xù)深入研究。該研究結果闡述ACBD3在腸道病毒復制過程中的作用機制。綜上所述,本研究發(fā)現ACBD3通過與EV71病毒蛋白3A相互作用定位于病毒的復制中心,形成EV71-3A-ACBD3-PI4KB分子復合物的形式促進EV71復制,同時ACBD3參與了 EV68病毒的復制,但并不參與HRV16病毒的復制。本研究發(fā)現了 ACBD3參與EV71病毒及其他腸道病毒復制的機制,為闡明腸道病毒的致病和復制機制提供理論依據,為藥物研發(fā)提供新的靶點。
【學位授予單位】：北京協和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R373

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 張楚瑜;腸道病毒在水環(huán)境中的分布及其行為[J];動物學報;1984年04期

2 張楚瑜;腸道病毒在水環(huán)境中的分布及其行為[J];生態(tài)學報;1984年04期

3 新宮正久,劉瑞璋;偶蹄類動物腸道病毒抗癌作用的研究——由鹿分離的腸道病毒性狀[J];哈爾濱醫(yī)科大學學報;1985年01期

4 陳宗波;人類腸道病毒71型感染的研究進展[J];中華兒科雜志;2005年06期

5 宋鴻碩;石爽;閻玲;莊輝;;腸道病毒71型研究進展[J];中國病原生物學雜志;2008年12期

6 陳鵬;陶澤新;王海巖;宋艷艷;王顯軍;徐愛強;;新型人類腸道病毒的研究進展[J];病毒學報;2013年02期

7 葉予;;研究獲得腸道病毒71型精確結構[J];前沿科學;2013年01期

8 陳姝蒙;丁崢嶸;趙智嫻;羅梅;田炳均;湯晶晶;張杰;陸林;;云南省2012年邊境地區(qū)健康兒童腸道病毒監(jiān)測及基因特征分析[J];中國病毒病雜志;2013年03期

9 馬子行;沈美s，

本文編號：1337234