本文關(guān)鍵詞：循環(huán)纖維細胞在實驗性矽肺發(fā)生發(fā)展中的作用與機制　出處：《鄭州大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景和目的矽肺是由于吸入游離二氧化硅(SiO_2)粉塵引起的以肺組織慢性炎癥和進展性纖維化為特征的全身性疾病,發(fā)病機制尚不明確。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),矽肺的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多種細胞參與、多因子調(diào)控的復(fù)雜過程。大量研究結(jié)果證實活化的成纖維細胞/肌成纖維細胞是分泌膠原蛋白、最終導(dǎo)致肺組織廣泛纖維化的主要終端效應(yīng)細胞。既往矽肺研究中主要關(guān)注肺成纖維細胞,近年來研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)纖維細胞(circulating fibrocyte,CF)具有炎癥趨化、類干細胞分化的特性,可能是成纖維細胞/肌成纖維細胞的又一主要來源。研究證實CF參與特發(fā)性肺纖維化等疾病發(fā)病過程,但其是否參與矽肺纖維化的發(fā)生發(fā)展,尚未見報道。因此,通過建立大鼠矽肺模型,輔以體外實驗,采用流式細胞術(shù)、免疫熒光、電子顯微鏡觀察等實驗技術(shù),系統(tǒng)研究循環(huán)纖維細胞在矽肺炎癥與纖維化形成期動態(tài)變化及可能作用與機制,進一步深化對矽肺發(fā)病機制的認識,尋找矽肺潛在的生物學(xué)標志及可能的關(guān)鍵靶點,為矽肺的預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)及有效干預(yù)提供新的思路和理論依據(jù)。材料和方法1.二氧化硅誘導(dǎo)循環(huán)纖維細胞轉(zhuǎn)分化的體外研究取SPF級雄性SD大鼠分離大鼠外周血單個核細胞,以含20%胎牛血清的DMEM調(diào)整細胞濃度2.5×106/ml,接種于6孔板后持續(xù)培養(yǎng)12 d,獲得CF。大鼠肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage,AM)的獲取采用支氣管肺泡灌洗法。免疫熒光雙染法觀察不同培養(yǎng)天數(shù)CF,流式細胞術(shù)檢測不同培養(yǎng)天數(shù)CF的比例。RT-PCR半定量法檢測Collagen I、Collagen III和α-SMA mRNA表達,酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測TGF-β1細胞因子分泌。免疫組織化學(xué)法檢測純化后繼續(xù)培養(yǎng)至第20 d的CFα-SMA蛋白表達。CCK8法測定不同濃度SiO_2粉塵在不同暴露時間下對AM和CF存活率的影響,確定后續(xù)染毒濃度。建立AM和培養(yǎng)6 d的外周血單個核細胞共培養(yǎng)模型探討SiO_2粉塵暴露對其向CF轉(zhuǎn)分化的影響,染毒24 h、48 h后流式細胞術(shù)檢測CF比例;qRT-PCR和免疫熒光法檢測SiO_2粉塵暴露后CF的Collagen I、Collagen III和α-SMA m RNA和蛋白表達;酶聯(lián)免疫吸附法檢測SiO_2暴露后CF培養(yǎng)上清中Collagen I、Collagen III和TGF-β1蛋白分泌水平。建立AM和純化后培養(yǎng)至20 d的CF共培養(yǎng)模型,染毒48 h,免疫組織化學(xué)法檢測CFα-SMA蛋白表達。2.實驗性矽肺大鼠循環(huán)纖維細胞分布規(guī)律和趨化行為的動態(tài)觀察隨機將72只SD雄性大鼠分為矽肺組和對照組。非暴露氣管滴注染塵法建立大鼠矽肺模型。建模后1、2、3、6、9、12周處死大鼠(矽肺組和對照組各6只),收集外周血、肺泡灌洗液和肺組織。HE和Masson染色觀察不同時段大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化和膠原沉積情況,鑒定大鼠矽肺模型。流式細胞術(shù)檢測大鼠外周血、肺組織中CF比例;免疫熒光雙染法檢測肺組織中CF分布及CF來源Collagen I分泌細胞所占比例及CF來源肌成纖維細胞比例和肺泡II型上皮細胞來源的肌成纖維細胞比例;免疫組織化學(xué)法檢測肺組織中CXCR4表達,ELISA法測定肺組織中CXCR4的配體CXCL12表達;Western blot檢測肺組織p-PI3K、p-Ser473-Akt、p-mTOR的蛋白表達;流式細胞術(shù)檢測肺泡灌洗液中Th1、Th2細胞數(shù)量變化,ELISA測定肺組織中Th1、Th2型細胞因子IFN-γ和IL-4及TGF-β1和IL-1β的表達。另選10只SD雄性大鼠觀察CF從外周血向肺內(nèi)遷移情況,CFSE活細胞熒光染料標記CF,尾靜脈注射入大鼠體內(nèi),立即對大鼠進行SiO_2染毒處理。1周后處死大鼠,免疫熒光法觀察肺組織中是否存在熒光標記的CF及其分布,流式細胞術(shù)檢測肺組織中CF所占比例。3.統(tǒng)計學(xué)分析運用SPSS17.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,分析結(jié)果以c±s表示,兩組獨立樣本間均數(shù)比較采用Student’s t檢驗,多組獨立樣本間比較采用ANOVA,LSD檢驗用于進一步進行兩兩比較,相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析,檢驗水準α=0.05。結(jié)果1.CF原代培養(yǎng)、鑒定及轉(zhuǎn)分化特性的觀察體外培養(yǎng)外周血單個核細胞,顯微鏡下可見淋巴樣圓形細胞減少,6 d后梭形及不規(guī)則樣細胞增多并開始增殖,12 d體積明顯增大呈典型的成纖維樣;隨著培養(yǎng)天數(shù)增加,CF細胞比例明顯升高,12 d后可以達到74.25%。隨著體外培養(yǎng)時間的延長,Collagen I、Collagen III的m RNA表達升高,9d和12 d最高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),α-SMA mRNA表達則呈初期高后期低趨勢;純化后的CF培養(yǎng)至第20 d開始表達α-SMA蛋白。2.SiO_2粉塵暴露對CF轉(zhuǎn)分化的觀察SiO_2粉塵染毒可以抑制AM和CF的活性。在相同染毒時間下,AM和CF的存活率均隨著SiO_2染毒濃度的升高而下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。對照組和染塵組CF比例均隨培養(yǎng)時間的延長而升高(與0 h組相比,P0.05);而相同時間段內(nèi),染塵組CF比例明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(與同時段對照組相比,P0.05)。與對照組和0 h組相比,48 h染塵組Collagen I和Collagen III mRNA表達和細胞培養(yǎng)上清中Collagen I和Collagen III分泌均明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。同時觀察到Collagen I和Collagen III定位于CF細胞質(zhì)中,未觀察到α-SMA蛋白表達。染塵組和對照組細胞培養(yǎng)上清中TGF-β1的表達均隨培養(yǎng)時間延長而升高,48 h組均達到最高,且染塵組比對照組明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。純化后的CF培養(yǎng)至20 d與AM建立共培養(yǎng)體系,染塵組與對照組相比,α-SMA蛋白表達明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.大鼠肺組織形態(tài)學(xué)及纖維化程度觀察染塵1、2周后肺泡壁明顯增寬,小氣道周圍及肺泡腔出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤;染塵3周后可見肺泡腔出現(xiàn)明顯的細胞性結(jié)節(jié),以炎性細胞聚集為主;6周后可見細胞性結(jié)節(jié)和纖維性結(jié)節(jié)形成,并出現(xiàn)結(jié)節(jié)融合現(xiàn)象;9、12周后可見大量纖維性結(jié)節(jié)出現(xiàn),肺泡結(jié)構(gòu)破壞,間隔斷裂及融合。矽肺大鼠肺組織膠原沉積面積百分比均高于對照組,且隨染塵時間的增加呈升高趨勢,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.大鼠外周血和肺組織中CF比例及其來源的Collagen I分泌細胞比例和分布與對照組相比,染塵2周至12周矽肺大鼠外周血中CF的比例均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與對照組相比,不同染塵時段矽肺大鼠肺組織單細胞懸液中CF的比例均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與對照組相比,不同染塵時段矽肺大鼠肺組織中CF占Collagen I分泌細胞比例均顯著升高(10%~16%),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。并且染塵初期CF主要位于血管和炎細胞聚集處,纖維化期可見CF存在于纖維結(jié)節(jié)內(nèi)。5.三種不同來源的肌成纖維細胞權(quán)重及變化趨勢與對照組相比,不同染塵時段矽肺大鼠肺組織中CF和II型肺泡上皮細胞來源的肌成纖維細胞均顯著升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。染塵不同時段,CF來源的肌成纖維細胞比例約15%~35%,而II型肺泡上皮細胞來源的肌成纖維細胞約9%~21%,計算肺成纖維細胞來源肌成纖維細胞的比例約為40%~65%。循環(huán)纖維細胞和肺泡II型上皮細胞來源肌成纖維細胞在染塵初期(1周、2周、3周)呈升高趨勢,染塵后期(6周、9周、12周)呈下降趨勢,肺成纖維細胞來源的肌成纖維細胞與上兩者趨勢相反。6.SiO_2粉塵暴露對CF體內(nèi)遷移及肺組織中CXCR4、CXCL12和PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白表達的影響染塵1周,CF可以從外周血遷移至肺內(nèi),與對照組相比,矽肺組大鼠肺組織中CFSE+CF占肺總細胞比例明顯升高,差異具有統(tǒng)計意義(P0.05),并且CF主要分布于血管周圍。與對照組相比,不同染塵時段矽肺大鼠肺組織中CXCR4的表達均明顯升高,1周至9周差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),并且1周最高。與對照組相比,1周、2周和3周矽肺組大鼠肺組織中CXCL12表達均升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與對照組相比,矽肺組大鼠肺組織中p-PI3K、p-Ser473-Akt、p-m TOR的蛋白表達在均在1周和2周明顯升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。7.大鼠肺泡灌洗液Th1、Th2細胞數(shù)量及肺組織中相關(guān)細胞因子的變化隨著染塵時間的延長,不同時段矽肺組大鼠肺泡灌洗液中Th1細胞比例呈下降趨勢,Th2細胞呈升高趨勢,Th1/Th2比值逐漸下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與對照組相比,Th1細胞比例1、2、3周升高,Th2細胞比例1、2周下降、9周和12周升高,Th1/Th2比值1、2、3周升高,12周下降,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與對照組相比,矽肺組大鼠肺組織中INF-γ表達在1周明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);IL-4表達水平1周降低,12周升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與對照組相比,矽肺組大鼠肺組織中TGF-β1表達在2周明顯升高,而IL-1β表達在染塵1到9周均顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。8.CF與Th1/Th2及相關(guān)細胞因子的關(guān)聯(lián)性分析染塵1周,CF來源Collagen I分泌細胞比例與Th1/Th2比值和肺內(nèi)INF-γ的水平均呈顯著正相關(guān)(r=0.879,P=0.021;r=0.942,P=0.005)。結(jié)論1.CF具有類干細胞分化特性,SiO_2體外和體內(nèi)暴露均促進外周血單個核細胞向CF轉(zhuǎn)分化,并促進CF向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化。2.在實驗性矽肺的發(fā)生發(fā)展過程中,CF可以由外周血遷移至肺部,炎癥反應(yīng)期肺內(nèi)CF來源的肌成纖維細胞增多最明顯,比例最高可達35%,是肌成纖維細胞的重要來源。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R135.2

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