本文關(guān)鍵詞：體外細(xì)胞培養(yǎng)模型中新型腎毒性生物標(biāo)志物的研究

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【摘要】：急性腎損傷是指腎功能的急劇下降,包括但不局限于急性腎衰竭。在臨床上,藥物誘發(fā)的急性腎損傷占所有腎損傷病例的33%左右。而在新藥研發(fā)過(guò)程中,藥物腎毒性往往是候選藥物被迫中斷后續(xù)開(kāi)發(fā)的主要原因之一,如何快速準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)腎毒性已成為藥物研發(fā)中的一個(gè)重要問(wèn)題。近年來(lái),在臨床和臨床前大鼠腎損傷研究中,一些新型腎毒性生物標(biāo)志物已被證實(shí)在早期檢測(cè)和靈敏度上都要優(yōu)于傳統(tǒng)的肌酐和尿素氮,并且具有損傷部位的特異性。但隨著對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物“3R”原則的倡導(dǎo)與實(shí)施,以及動(dòng)物與人體種屬差異性造成的臨床前數(shù)據(jù)外推至人體的局限性,建立準(zhǔn)確、高通量的體外評(píng)價(jià)替代方法,已逐漸成為腎毒性研究的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)。這些新的生物標(biāo)志物能否在體外評(píng)價(jià)中更加準(zhǔn)確、靈敏地預(yù)測(cè)腎毒性尚有待研究。隨著中藥在臨床上的廣泛應(yīng)用,中藥引起的腎損傷日益受到人們的重視,是繼抗生素、解熱鎮(zhèn)痛藥以外藥物性腎損害的重要病因之一,已成為制約中藥現(xiàn)代化和臨床應(yīng)用的一大障礙。中藥成份復(fù)雜、靶點(diǎn)多,引起腎毒性的病理表現(xiàn)和毒性機(jī)制更為復(fù)雜多樣,而采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)中藥成份進(jìn)行毒理學(xué)研究則耗時(shí)耗力。因此,尋找準(zhǔn)確可靠的中藥腎毒性體外毒性評(píng)價(jià)方法也是中藥現(xiàn)代化的發(fā)展趨勢(shì)。為了探求在腎毒性體外評(píng)價(jià)模型中更為靈敏、特異的早期檢測(cè)指標(biāo),并建立中藥腎毒性體外評(píng)價(jià)體系。本課題采用肝腎毒性藥物,建立藥物腎毒性的體外評(píng)價(jià)模型,篩選腎細(xì)胞模型中潛在的腎毒性生物標(biāo)志物,比較各檢測(cè)指標(biāo)在不同腎細(xì)胞模型上對(duì)腎毒性的預(yù)測(cè)效能,并初步探索新型生物標(biāo)志物在中藥腎毒性體外評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。以腎毒性藥物慶大霉素、順鉑、馬兜鈴酸Ⅰ和環(huán)孢素為陽(yáng)性工具藥,以肝毒性藥物環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤和無(wú)肝腎毒性藥物左旋多巴為陰性對(duì)照,考察藥物對(duì)L-02細(xì)胞、MDCKII細(xì)胞、HK-2細(xì)胞和RPTEC/TERT1細(xì)胞的毒性作用。腎毒性藥物慶大霉素、順鉑、馬兜鈴酸1和環(huán)孢素在L-02細(xì)胞中半數(shù)抑制濃度(IC50)值高于MDCKII細(xì)胞、HK-2細(xì)胞和RPTEC/TERT1細(xì)胞:肝毒性藥物硫唑嘌呤和環(huán)磷酰胺在L-02細(xì)胞中IC50值低于MDCKII細(xì)胞、HK-2細(xì)胞和RPTEC/TERT1細(xì)胞;陰性對(duì)照藥物左旋多巴在四種細(xì)胞的IC50值都大于10000 μM。肝毒性和腎毒性藥物在肝腎細(xì)胞上IC50值的差異,可初步篩選藥物的潛在靶器官毒性。另外,分別選擇腎毒性藥物慶大霉素、順鉑、馬兜鈴酸Ⅰ和環(huán)孢素各自IC50的1/5和2/5濃度處理四種細(xì)胞24 h,均能誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡,且凋亡率具有濃度依賴(lài)性,說(shuō)明腎毒性藥物對(duì)肝腎細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用是由凋亡誘導(dǎo)的。這些結(jié)果為生物標(biāo)志物的篩選確定了合適的藥物濃度。在腎毒性藥物慶大霉素、順鉑、馬兜鈴酸Ⅰ和環(huán)孢素誘導(dǎo)MDCKII細(xì)胞、HK-2細(xì)胞和RPTEC/TERT1細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況下,檢測(cè)傳統(tǒng)酶學(xué)生物標(biāo)志物和新型生物標(biāo)志物的水平,篩選出了潛在的高靈敏度生物標(biāo)志物。相對(duì)于溶媒對(duì)照組,在MDCKII細(xì)胞,藥物組的新型生物標(biāo)志物叢生蛋白(clusterin)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(CysC)、骨橋蛋白(osteopontin)和傳統(tǒng)酶學(xué)生物標(biāo)志物乳酸脫氫酶(LDH)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)有顯著性差異;在HK-2細(xì)胞,藥物組的新型生物標(biāo)志物clusterin、CysC、osteopontin、腎損傷因子-1(KIM-1)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶π(GSTπ)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(NGAL)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)和傳統(tǒng)酶學(xué)生物標(biāo)志物L(fēng)DH、GGT有顯著性差異;在RPTEC/TERT1細(xì)胞,藥物組的新型生物標(biāo)志物clusterin、CysC、TIMP-1、GSTπ和傳統(tǒng)酶學(xué)生物標(biāo)志物L(fēng)DH、GGT有顯著性差異。這些生物標(biāo)志物有成為腎毒性體外評(píng)價(jià)檢測(cè)指標(biāo)的潛在優(yōu)勢(shì),其靈敏度和特異性還需更多化合物的驗(yàn)證。采用22種化合物(12種腎小管毒性藥物,10種非腎小管毒性藥物),通過(guò)logistic回歸和受試者工作特征(ROC)分析,進(jìn)一步評(píng)價(jià)HK-2細(xì)胞和RPTEC/TERT1細(xì)胞中細(xì)胞毒性指標(biāo)細(xì)胞存活率(cell viability)、傳統(tǒng)酶學(xué)生物標(biāo)志物(GGT、LDH)和新型生物標(biāo)志物(clusterin、KIM-1、CysC、GSTπ、osteopontin、NGAL、TIMP-1)的預(yù)測(cè)效能。在HK-2細(xì)胞,生物標(biāo)志物的預(yù)測(cè)效能依次是KIM-1clusterinosteopontinCysCNGALTIMP-1 = GSTπ = LDHcell viability = GGT;KIM-1、clusterin和osteopontin的聯(lián)合分析,預(yù)測(cè)效能相對(duì)于單個(gè)生物標(biāo)志物明顯提高。在RPTEC/TERT1細(xì)胞,生物標(biāo)志物的預(yù)測(cè)效能依次是CysC = clusterinTIMP-1GSTπLDH = GGTcell viability;CysC 和 clusterin 的聯(lián)合分析預(yù)測(cè)效能比 CysC、clusterin高。結(jié)果表明,在HK-2細(xì)胞和RPTEC/TERT1細(xì)胞模型中,新型生物標(biāo)志物的預(yù)測(cè)效能明顯高于傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性指標(biāo)和傳統(tǒng)酶學(xué)生物標(biāo)志物。最后,采用16種中藥單體,進(jìn)一步驗(yàn)證了 HK-2細(xì)胞中新型生物標(biāo)志物KIM-1、osteopontin、clusterin、CysC、TIMP-1、NGAL對(duì)中藥腎小管毒性的預(yù)測(cè)效能明顯高于傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性指標(biāo)cell viability。在最佳閾值時(shí),這些新型生物標(biāo)志物對(duì)中藥腎小管毒性的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、靈敏度和特異性明顯高于細(xì)胞毒性指標(biāo)。本研究建立的基于新型生物標(biāo)志物的腎毒性體外替代方法,對(duì)腎毒性的預(yù)測(cè)效能明顯高于傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性指標(biāo),提高了腎毒性體外評(píng)價(jià)的靈敏度和靶器官特異性,將有助于新藥研發(fā)的化合物早期篩選和毒性機(jī)制研究。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R285.1

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6 馬t，

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