本文關(guān)鍵詞：自噬在吉非替尼肝臟毒性中的作用及其機制研究

  更多相關(guān)文章： 吉非替尼(Gefitinib) 肝臟毒性 自噬 凋亡 COX6A1 PLK1

【摘要】：研究目的:吉非替尼(Gefitinib)是目前臨床應用最廣泛的酪氨酸激酶抑制劑之一,但其嚴重的肝臟毒性常造成部分患者中斷治療,甚至導致個別患者的死亡。而目前針對其毒性機制尚無研究報道,更缺乏有效的干預手段。我們前期研究發(fā)現(xiàn),Gefitinib可通過誘導肝細胞凋亡導致肝臟毒性,自噬可能參與該毒性發(fā)生過程。本課題旨在探索自噬在Gefitinib肝臟毒性中的作用,闡明自噬與凋亡之間的相互關(guān)系,并基于此研究干預Gefitinib肝臟損傷的新策略,拓展其臨床應用。研究方法:第一部分:自噬在Gefitinib肝臟毒性中的作用研究(1)建立Gefitinib肝臟毒性ICR小鼠模型,通過肝臟臟器指數(shù),血液生化指標谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和乳酸脫氫酶(LDH)以及蘇木精-伊紅染色法(HE)分析病理切片,確證Gefitinib肝臟毒性的發(fā)生;(2)肝臟組織免疫組化和TUNEL染色實驗確證肝臟組織中肝細胞凋亡發(fā)生情況;(3)采用SRB染色法檢測Gefitinib對人正常肝細胞HL7702(L02)的增殖抑制能力;(4)Western blot、DAPI染色和Annexin V/PI雙染結(jié)合流式細胞術(shù)實驗檢測凋亡發(fā)生情況;(5)免疫透射電鏡(TEM)、western blot、免疫組化和丫啶橙(AO)染色結(jié)合流式細胞術(shù)實驗檢測體內(nèi)外自噬發(fā)生情況;(6)采用特異性Caspase泛抑制劑Z-VAD-FMK抑制凋亡,結(jié)合western blot、PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)考察抑制細胞凋亡對自噬的影響;(7)采用小分子RNA干擾技術(shù)沉默Atg5,結(jié)合western blot、PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)考察抑制細胞自噬對凋亡的影響;(8)采用cre-loxp系統(tǒng)建立肝臟特異性敲除自噬關(guān)鍵基因Atg7的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并結(jié)合肝臟臟器指數(shù)、血液生化指標、HE病理切片以及免疫組化等實驗手段考察自噬與Gefitinib肝臟損傷的關(guān)系,以及初步確證自噬對肝細胞凋亡的調(diào)控作用。第二部分:Gefitinib介導的自噬調(diào)控肝細胞凋亡的分子機制研究(1)應用TMT定量蛋白質(zhì)組學分析尋找并確證Gefitinib誘導自噬降解的關(guān)鍵蛋白;(2)采用溶酶體抑制劑氯喹(CQ)抑制自噬,結(jié)合western blot驗證Gefitinib誘導自噬降解的可能底物蛋白;(3)采用小分子RNA干擾技術(shù)沉默Atg5,以排除小分子抑制劑脫靶效應,結(jié)合western blot確證Gefitinib誘導自噬降解的底物蛋白為COX6A1;(4)根據(jù)電鏡結(jié)果,統(tǒng)計對照組與給藥組小鼠肝細胞內(nèi)線粒體數(shù)目,western blot檢測線粒體基質(zhì)蛋白Hsp60和膜蛋白Tomm20,考察線粒體數(shù)目的變化;(5)分離肝細胞內(nèi)線粒體,western blot檢測Gefitinib作用下胞漿和線粒體中COX6A1蛋白水平的變化;(6)Western blot檢測Gefitinib不同濃度和時間作用下肝細胞L02中COX6A1蛋白水平的變化;(7)Western blot檢測ICR小鼠肝臟中Gefitinib作用下COX6A1蛋白水平的變化;(8)構(gòu)建過表達COX6A1細胞,結(jié)合western blot和PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)考察過表達COX6A1對肝細胞凋亡的影響;(9)采用 real-time PCR(RT-PCR)實驗考察 Gefitinib 對 COX6A1 mRNA 水平的影響;(10)采用蛋白合成抑制劑放線菌酮(CHX)與Gefitinib共同作用,結(jié)合western blot考察Gefitinib對COX6A1蛋白合成水平的影響;(11)采用蛋白酶體抑制劑MG132與Gefitinib共同作用,結(jié)合western blot考察泛素蛋白酶體通路在COX6A1蛋白下調(diào)中的作用;(12)采用選擇性PI3K抑制劑3-MA抑制自噬,結(jié)合western blot考察自噬溶酶體通路在Gefitinib誘導COX6A1下調(diào)中的作用;(13)采用自噬關(guān)鍵基因Atg5、Atg7敲除的MEF細胞,自噬關(guān)鍵基因Atg7敲除的肝臟組織,進一步考察自噬溶酶體通路在Gefitinib干預COX6A1蛋白穩(wěn)定性中的作用。第三部分:Gef-itinib誘導肝細胞自噬發(fā)生的機制及其干預策略研究(1)采用 SRB 染色法、western blot 考察 Gefitinib、Erlotinib 和 Afatinib 作用下肝細胞中COX6A1蛋白水平的變化;(2)采用小分子RNA干擾技術(shù)沉默肝細胞中表皮生長因子受體(EGFR)蛋白,結(jié)合western blot考察肝細胞中COX6A1、c-PARP和LC3蛋白水平的變化,探討Gefitinib作用靶點EGFR在其自噬中的作用;(3)采用western blot考察在Gefitinib作用后PLK1蛋白水平的變化;(4)采用RT-PCR考察Gefitinib對PLK1mRNA水平的影響;(5)肝組織切片進行HE染色和免疫組化實驗考察PLK1與損傷部位共定位情況;(6)通過ICR小鼠模型,采用血液生化指標和western blot檢測確定PLK1蛋白水平變化與Gefitinib誘導肝臟損傷發(fā)生時間先后關(guān)系;(7)沉默和過表達PLK1蛋白,結(jié)合western blot考察其與Gefitinib誘導的肝細胞自噬之間的關(guān)系;(8)Western blot檢測PLK1抑制劑BI-2536對Gefitinib誘導的肝細胞自噬的影響;(9)PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)考察PLK1抑制劑BI-2536對Gefitinib誘導的肝細胞凋亡的影響;(10)采用ICR小鼠模型,結(jié)合肝臟臟器指數(shù),血液生化指標和HE病理切片檢測,研究PLK1抑制劑BI-2536在體內(nèi)對Gefitinib肝臟毒性的保護作用;(11)采用肺癌細胞PC9、H1299和H460,采用SRB染色法檢測PLK1抑制劑BI-2536對Gefitinib抗腫瘤藥效的影響。研究結(jié)果:第一部分:細胞自噬在Gefitinib肝臟毒性中的作用研究(1)體內(nèi)外實驗證實Gefitinib誘導肝細胞凋亡Gefitinib200mg/kg灌胃給于ICR小鼠4周后,出現(xiàn)了與臨床報道一致的肝臟功能紊亂。肝臟臟器指數(shù)與對照組比明顯升高,從對照組的4.05 ±0.33%升高到Gefitinib給藥組的5.24 ± 0.61%。Gefitinib給藥組血清中的ALT、AST和LDH含量是對照組的2～10倍。Gefitinib給藥組肝臟切片進行HE染色,結(jié)果顯示肝臟出現(xiàn)嗜酸性變。進一步采用免疫組化法檢測肝臟組織切片中cleaved-PARP(c-PARP)蛋白的表達情況,發(fā)現(xiàn)損傷部位c-PARP明顯升高。TUNEL染色結(jié)果也顯示Gefitinib給藥組小鼠肝組織切片中,綠色熒光強度明顯增加。以上結(jié)果表明Gefitinib誘導肝細胞凋亡可能是其誘導損傷的原因。SRB染色法實驗證實Gefitinib可顯著抑制肝細胞L02增殖能力,計算得出IC50為19.9μM。Annexin V/PI雙染結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞死亡方式,結(jié)果顯示,肝細胞凋亡比例隨Gefitinib給藥濃度或時間的增加而增加。DAPI染色結(jié)果顯示Gefitinib作用后細胞核出現(xiàn)了典型的凋亡特征,細胞核明顯固縮,同時出現(xiàn)凋亡小體。Westernblot結(jié)果顯示,Gefitinib作用后肝細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白PARP切割片段c-PARP明顯增加。以上結(jié)果從體內(nèi)外證實Gefitinib通過誘導肝細胞凋亡,進而引發(fā)肝臟毒性。(2)體內(nèi)外實驗證實Gefitinib誘導肝細胞凋亡的同時誘導細胞自噬采用免疫透射電鏡實驗發(fā)現(xiàn)Gefitinib組小鼠肝臟組織出現(xiàn)典型自噬泡結(jié)構(gòu)。Western blot結(jié)果也表明Gefitinib給藥組小鼠肝臟組織中自噬標記蛋白LC3 Ⅰ型向LC3 Ⅱ型轉(zhuǎn)換明顯增加。采用免疫組化法檢測Gefitinib組小鼠肝臟組織切片中LC3蛋白的表達情況,發(fā)現(xiàn)損傷部位LC3明顯升高且成點狀聚集。進一步在體外肝細胞L02中,免疫透射電鏡也檢測到Gefitinib作用后出現(xiàn)的自噬泡結(jié)構(gòu)。AO染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,Gefitinib不同濃度0 μM、5 μM、10 μM和20 μM和Gefitinib20μM濃度下不同時間0、6、12和24小時對應的AO陽性細胞率分別為14.01 ± 3.22%、19.78 ± 1.51%、21.34 ± 5.97%、37.46 ± 4.07%和 14.88 ± 0.63%、16.76 ± 3.80%、24.40 ± 1.95%、40.01 ±7.67%,AO 陽性細胞比例隨 Gefitinib 給藥濃度或時間的增加而增加。Western blot結(jié)果顯示Gefitinib組肝細胞自噬標記蛋白LC3Ⅰ型向LC3Ⅱ型轉(zhuǎn)換明顯增加。以上結(jié)果從體內(nèi)外證實,Gefitinib誘導肝細胞凋亡同時誘導自噬。(3)Gefitinib介導的自噬是其肝細胞凋亡依賴的肝臟毒性的關(guān)鍵原因采用Caspase泛抑制劑Z-VAD-FMK抑制Gefitinib引起的肝細胞凋亡,PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,肝細胞凋亡率從52.95±20.70%降至20.59±18.50%。而SRB染色實驗和western blot結(jié)果顯示,抑制肝細胞凋亡并不影響Gefitinib誘導的自噬發(fā)生和細胞數(shù)目減少。采用小分子RNA干擾技術(shù)沉默自噬關(guān)鍵蛋白Atg5的表達,western blot實驗結(jié)果顯示,抑制自噬可以逆轉(zhuǎn)Gefitinib引起的c-PARP增加。SRB染色實驗結(jié)果顯示,抑制自噬后細胞存活率從Gefitinib作用后的55.12±4.58%回升到86.41 ±0.81%。PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,抑制自噬后肝細胞肝細胞凋亡率從57.22± 11.25%降至24.72±4.17%。以上結(jié)果初步說明抑制自噬可以抑制Gefitinib引起的肝細胞凋亡,進而逆轉(zhuǎn)Gefitinib肝臟毒性。進一步采用肝臟特異性敲除自噬關(guān)鍵基因Atg7的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,肝臟臟器指數(shù)、血液生化指標和HE病理切片結(jié)果顯示,抑制自噬可以保護Gefitinib引起的肝毒性。肝臟免疫組化結(jié)果顯示,抑制自噬可以抑制Gefitinib引起的肝細胞凋亡。以上結(jié)果從體內(nèi)外證實自噬是Gefitinib引起肝細胞凋亡,進而導致肝臟毒性的關(guān)鍵原因。第二部分:Gefitinib介導的自噬調(diào)控肝細胞凋亡的分子機制研究(1)TMT定量蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)COX6A1是Gefitinib介導自噬降解的底物蛋白Western blot結(jié)果顯示,CQ作用下蛋白LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ型轉(zhuǎn)換明顯增加,說明CQ抑制自噬溶酶體以及其包含蛋白的降解。我們將對照組,Gefitinib給藥組和Gefitinib + CQ組進行TMT定量蛋白質(zhì)組學分析,質(zhì)譜鑒定得到6448個差異蛋白。我們對變化倍數(shù)大于1.3的蛋白進一步進行分析,Gefitinib作用下蛋白水平下降的有36個,合用CQ后蛋白水平回升的有18個,在兩者中相同的蛋白有3個,分別為B2M,COX6A1和TUBB8。Western blot結(jié)果顯示,Gefitinib引起的這三個蛋白的降解均能夠被CQ逆轉(zhuǎn)。進一步采用小分子RNA干擾技術(shù)沉默Atg5抑制自噬,只有COX6A1能夠被逆轉(zhuǎn),B2M和TUBB8則不可以,說明CQ所逆轉(zhuǎn)B2M和TUBB8是自噬溶酶體途徑非依賴的。統(tǒng)計電鏡實驗中對照組和給藥組小鼠肝細胞內(nèi)線粒體數(shù)目,結(jié)果顯示兩者沒有顯著變化。同時western blot結(jié)果顯示給予Gefitinib不影響線粒體基質(zhì)蛋白Hsp60和線粒體膜蛋白Tomm20蛋白水平。分離線粒體與細胞漿,western blot結(jié)果顯示,Gefitinib作用后線粒體內(nèi)COX6A1蛋白水平顯著下降。給予肝細胞L02不同濃度和時間的Gefitinib,western blot結(jié)果顯示,COX6A1蛋白水平的下調(diào)具有濃度和時間依賴性。ICR小鼠肝臟組織中,Gefitinib作用下COX6A1蛋白水平也顯著下降。以上結(jié)果表明,COX6A1可能是Gefitinib介導自噬降解的底物蛋白。(2)COX6A1蛋白參與調(diào)控Gefitinib介導的肝細胞凋亡構(gòu)建過表達COX6A1蛋白的肝細胞,給予Gefitinib作用24小時。Western blot結(jié)果顯示,過表達COX6A1能夠逆轉(zhuǎn)Gefitinib引起的c-PARP增加。PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測顯示,過表達COX6A1能夠減少Gefitinib引起的肝細胞凋亡,肝細胞凋亡率從Gefitinib給藥后的53.89 ± 14.27%降到28.39 ± 3.46%。以上結(jié)果說明,COX6A1可能是Gefitinib誘導肝細胞凋亡的關(guān)鍵原因。(3)Gefitinib作用下COX6A1蛋白經(jīng)由自噬溶酶體途徑降解采用RT-PCR檢測,結(jié)果顯示Gefitinib作用下,COX6A1mRNA水平并不隨著時間濃度變化而變化,說明Gefitinib不影響COX6A1轉(zhuǎn)錄水平。采用蛋白合成抑制劑CHX結(jié)合western blot結(jié)果顯示,Gefitinib不影響COX6A1的蛋白合成水平,提示蛋白降解途徑參與Gefitinib誘導的COX6A1下調(diào)。通過泛素蛋白酶體抑制劑MG132證實Gefitinib作用下COX6A1的下調(diào)不經(jīng)由泛素蛋白酶體途徑。采用選擇性PI3K抑制劑3-MA抑制自噬,western blot結(jié)果顯示,Gefitinib誘導的COX6A1蛋白下調(diào)能夠被逆轉(zhuǎn),初步證實COX6A1經(jīng)由自噬溶酶體途徑降解。進一步對敲除自噬關(guān)鍵基因Atg5以及Atg7的MEF細胞,自噬關(guān)鍵基因Atg7敲除的肝臟組織的運用,確證了 Gefitinib誘導COX6A1經(jīng)由自噬溶酶體通路降解。第三部分:Gefitinib誘導自噬發(fā)生的機制及其干預策略研究(1)Gefitinib激活的肝細胞自噬不依賴于其靶點EGFR采用其他EGFR抑制劑Erlotinib和Afatinib考察Gefitinib介導的COX6A1自噬降解是否是其靶點效應,通過SRB染色法確定Erlotinib和Afatinib在肝細胞上作用濃度分別為20 μM和5 μM,western blot結(jié)果顯示,僅在Gefitinib作用下COX6A1蛋白下調(diào),而Erlotinib和Afatinib作用下不變。進一步采用小分子RNA干擾技術(shù)沉默EGFR,western blot結(jié)果顯示沉默EGFR也不引起肝細胞內(nèi)COX6A1蛋白的下調(diào),且沉默EGFR并不影響Gefitinib誘導自噬的發(fā)生和細胞凋亡的發(fā)生。(2)PLK1調(diào)控Gefitinib誘導的肝細胞自噬采用western blot檢測PLK1在Gefitinib作用下變化情況,結(jié)果顯示,PLK1隨Gefitinib作用濃度和時間的增加而增加。同時在原代肝細胞中也觀察到相同現(xiàn)象。采用RT-PCR檢測,結(jié)果顯示Gefitinib作用下,PLK1 mRNA水平隨著時間濃度變化而變化,說明Gefitinib通過影響PLK1轉(zhuǎn)錄水平增加其蛋白表達。采用HE染色結(jié)合免疫組化進一步分析,結(jié)果顯示,在肝細胞損傷部位PLK1表達顯著升高。體內(nèi)ICR小鼠不同時間的血清及肝臟組織結(jié)果顯示,Gefitinib給藥后血液生化指標在第三周才開始出現(xiàn)變化,而肝臟中PLK1蛋白水平則在第二周出現(xiàn)明顯升高。以上結(jié)果說明肝細胞中PLK1蛋白水平在Gefitinib給藥后顯著升高,并且早于肝損傷的發(fā)生,提示PLK可能與Gefitinib誘導的肝臟損傷存在著密切的關(guān)系。采用小分子RNA干擾技術(shù)沉默PLK1表達,western blot結(jié)果顯示沉默PLK1可以顯著抑制Gefitinib引起的肝細胞自噬,而過表達PLK1蛋白則會引起肝細胞自噬。以上結(jié)果說明,Gefitinib可通過上調(diào)PLK1,進而誘導肝細胞自噬,最終引起肝臟毒性。(3)PLK1抑制劑干預Gefitinib肝臟毒性研究前期結(jié)果提示PLK可能是Gefitinib肝臟毒性的干預靶點。我們采用PLK1抑制劑BI-2536與Gefitinib進行合用,westernblot結(jié)果顯示BI-2536可以抑制Gefitinib引起的肝細胞LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ型轉(zhuǎn)換。PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測顯示,BI-2536可以抑制Gefitinib引起的肝細胞凋亡,凋亡率從Gefitinib作用后的47.78 ±13.41下降到30.43 ± 5.96%。體內(nèi)ICR小鼠實驗結(jié)果顯示,BI-2536可以使肝臟臟器指數(shù)回到正常水平,從Gefitinib給藥組的5.11 ±0.38%回到4.22 ±0.25%。同時BI-2536還可逆轉(zhuǎn)Gefitinib引起的肝臟血液生化指標的升高。肝組織HE染色結(jié)合免疫組化實驗結(jié)果顯示,BI-2536通過抑制體內(nèi)肝細胞自噬,進而抑制肝細胞凋亡,最終阻止Gefitinib肝臟毒性的發(fā)生。為了進一步驗證PLK1抑制劑作為Gefitinib肝臟毒性干預策略的臨床可行性,我們考察了 BI-2536對Gefitinib抗腫瘤藥效的影響。在Gefitinib敏感細胞株非小細胞肺癌PC9,以及不敏感的肺癌細胞H1299和H460中,合用BI-2536不影響Gefitinib的抗腫瘤效應。以上結(jié)果說明,BI-2536在對抗Gefitinib肝臟毒性的同時,不會影響其抗腫瘤效果。研究結(jié)論:自噬是肝細胞凋亡依賴的Gefitinib肝臟毒性的關(guān)鍵原因。自噬促使線粒體相關(guān)蛋白COX6A1發(fā)生自噬溶酶體途徑降解,進而引起肝細胞凋亡。PLK1參與調(diào)控Gefitinib引起的肝細胞自噬,PLK1抑制劑BI-2536可以在不影響Gefitinib抗腫瘤作用的同時改善Gefitinib引起的肝臟損傷。通過本課題的研究闡明了 Gefitinib肝臟毒性的發(fā)生機制,為臨床Gefitinib的廣泛應用及其肝臟毒性的防治提供了有效可行的策略。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Po-Yuan Ke;Steve S-L Chen;;Autophagy in hepatitis C virus-host interactions:Potential roles and therapeutic targets for liver-associated diseases[J];World Journal of Gastroenterology;2014年19期

，

本文編號：1276316