本文關(guān)鍵詞：瘦素對(duì)慢性腎臟病患者內(nèi)皮功能紊亂的影響及分子機(jī)制研究

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【摘要】：背景/目的慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是全球危害人類健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題,具有高發(fā)病率、高致殘率、高醫(yī)療費(fèi)用、低知曉率的流行病學(xué)特點(diǎn)。心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是慢性腎臟病(CKD)最主要的并發(fā)癥,也是CKD患者最主要的死亡原因,其死亡率約占慢性腎臟病患者總死亡率的44%～51%。心血管疾病的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素不足以解釋CKD患者心血管事件高發(fā)的原因,因此,其他非傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素如內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂引起了許多學(xué)者的重視。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是心血管事件的起始因素,且臨床及實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí),血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的改變與慢性腎臟病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此,尋找CKD患者血管內(nèi)皮功能紊亂的影響因素并深入研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的發(fā)生機(jī)制、早期準(zhǔn)確地對(duì)CKD患者血管內(nèi)皮功能進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估,對(duì)CKD患者心血管疾病的診斷、治療及預(yù)后具有重要意義。瘦素是一種脂肪細(xì)胞因子。以往研究認(rèn)為,瘦素主要在調(diào)節(jié)機(jī)體攝食和能量代謝中發(fā)揮重要作用。隨著研究的深入,瘦素在神經(jīng)內(nèi)分泌、血管新生、生殖發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和創(chuàng)傷修復(fù)等方面的作用也逐漸被人們認(rèn)識(shí)。近年來(lái)大量臨床研究顯示,血清瘦素水平與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān),而且體外實(shí)驗(yàn)也提示瘦素可以誘導(dǎo)高血壓及蛋白尿的發(fā)生,并可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。腎臟是瘦素清除的主要器官,已有研究表明,瘦素在慢性腎臟病患者血清中的濃度升高。然而,關(guān)于瘦素與慢性腎臟病的關(guān)系,特別是瘦素對(duì)慢性腎臟病患者內(nèi)皮功能紊亂的影響的相關(guān)研究甚少。因此,本研究旨在評(píng)估慢性腎臟病患者的血清瘦素水平以及血管內(nèi)皮的功能狀態(tài),分析CKD患者血清瘦素水平與內(nèi)皮功能障礙的關(guān)系,并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證瘦素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能改變的影響,探討其作用的可能的分子學(xué)機(jī)制,從而為理解慢性腎臟病患者心血管事件的高發(fā)病率、改善CKD預(yù)后提供新的思路,并為進(jìn)一步研究有效干預(yù)和治療CKD患者內(nèi)皮功能障礙提供新的理論依據(jù)。研究方法本研究分為臨床研究和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩部分,分別完成慢性腎臟病患者血清瘦素水平與內(nèi)皮功能紊亂的相關(guān)性分析及瘦素誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的分子機(jī)制研究。1臨床研究本研究共納入140例臨床病情穩(wěn)定的成人非糖尿病性CKD病人及140例性別、年齡匹配的健康成年人,收集所有研究對(duì)象的性別、年齡、身高、體重、血壓等基本資料及血脂、血糖、肝腎功能、超敏C反應(yīng)蛋白等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo),并采集空腹血標(biāo)本,通過(guò)ELISA檢測(cè)研究對(duì)象血清瘦素含量以及內(nèi)皮功能紊亂的血清學(xué)指標(biāo)sICAM-1和sVCAM-1的濃度。采用無(wú)創(chuàng)超聲測(cè)定右肱動(dòng)脈血流介導(dǎo)的血管舒張功能(flow-mediated dilation,FMD)進(jìn)一步評(píng)估46例病人及30例健康人的血管內(nèi)皮功能,該指標(biāo)用肱動(dòng)脈直徑的舒張百分比表示。采用SPSS軟件對(duì)臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,比較兩組間同一指標(biāo)的差異,并采用Spearman相關(guān)來(lái)分析CKD病人兩個(gè)變量之間的相關(guān)性,借此探討慢性腎臟病患者血清瘦素水平變化及其與內(nèi)皮功能狀態(tài)的關(guān)系。雙側(cè)P值0.05定義為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2體外實(shí)驗(yàn)2.1瘦素對(duì)HUVECs黏附分子合成的影響:體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,使用瘦素(100 ng/ml)刺激HUVECs不同時(shí)間,收集HUVECs上清,離心后采用ELISA檢測(cè)上清液中可溶性ICAM-1、VCAM-1的水平,并以此確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中瘦素對(duì)HUVECs的刺激時(shí)間;瘦素(100 ng/ml)刺激HUVECs 24小時(shí)后,分別采用western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1在蛋白質(zhì)水平及mRNA水平的表達(dá)。2.2瘦素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響:同時(shí)采用Transwell(聚碳酯膜,濾膜孔徑:8.0 μm)遷移實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)瘦素對(duì)HUVECs活動(dòng)力的影響。2.3瘦素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的影響:Transwell上室(聚酯膜,濾膜孔徑:0.4 μm)培養(yǎng)HUVECs形成內(nèi)皮細(xì)胞單層,通過(guò)檢測(cè)內(nèi)皮單層對(duì)FITC-dextan的通透性,探索瘦素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的影響。2.4瘦素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞骨架重排的影響:免疫熒光染色后采用激光共聚焦顯微鏡觀察瘦素刺激下臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞骨架蛋白F-actin和vinculin的變化。2.5瘦素誘導(dǎo)內(nèi)皮功能紊亂的分子機(jī)制:western blot檢測(cè)瘦素處理后AKT/GSK3β通路的活性變化及其對(duì)β-catenin信號(hào)的影響,包括AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白的表達(dá)情況;β-catenin總蛋白和核蛋白的表達(dá)變化。為驗(yàn)證AKT及β-catenin信號(hào)通路在瘦素誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂中的作用,我們進(jìn)一步構(gòu)建了 AKTshRNA質(zhì)粒及β-cateninshRNA慢病毒,并分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞,檢測(cè)AKT或β-catenin基因敲除后瘦素刺激下黏附分子的表達(dá)、內(nèi)皮細(xì)胞遷移及通透性的改變,以及細(xì)胞骨架重排的變化。結(jié)果1臨床研究1.1與健康人相比,慢性腎臟病患者血清瘦素水平明顯升高(P=0.006)。1.2與健康人相比,慢性腎臟病患者血清sICAM-1、sVCAM-1水平升高,FMD水平明顯減低(median(Q1,Q3),4.3(2.1-6.4)in patients vs.6.4(2.4-12.5)in controls,P0.05)。1.3 Spearman相關(guān)性分析顯示,慢性腎臟病患者血清瘦素水平與sICAM-1、sVCAM-1 濃度均呈正相關(guān)(sICAM-1:r=0.194,P=0.019;sVCAM-1:r=0.183,P=0.027);在進(jìn)行了 FMD測(cè)量的46例CKD患者中,血清瘦素水平與FMD呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.418,P=0.004)。2體外實(shí)驗(yàn)2.1瘦素可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子合成增加:以瘦素刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞6,12,24及48小時(shí),與對(duì)照組相比,上清液中sICAM-1及sVCAM-1水平在12小時(shí)即可見(jiàn)升高,24小時(shí)后達(dá)到最明顯作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且,瘦素刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)后,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1總蛋白及mRNA的表達(dá)均明顯增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2瘦素可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移:與正常對(duì)照組相比,瘦素刺激組劃痕愈合速度較快,遷移穿過(guò)Transwell膜的細(xì)胞數(shù)多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.3瘦素可增加內(nèi)皮細(xì)胞單層的通透性:與正常對(duì)照組相比,瘦素刺激組Transwell下室FITC-dextran的熒光強(qiáng)度明顯增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.4瘦素可誘導(dǎo)HUVECs的細(xì)胞骨架重排:與正常對(duì)照組相比,瘦素刺激后內(nèi)皮細(xì)胞F-actin重排,分布在細(xì)胞邊緣的肌動(dòng)蛋白纖維減少,橫跨細(xì)胞體的應(yīng)力纖維明顯增多、變粗,且排列紊亂,同時(shí)伴有vinculin重組。2.5瘦素誘導(dǎo)內(nèi)皮功能紊亂的分子機(jī)制2.5.1瘦素通過(guò)活化AKT/GSK3 β通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂:與正常對(duì)照組相比,瘦素刺激組內(nèi)皮細(xì)胞AKT磷酸化水平增加,同時(shí)伴有p-GSK3β過(guò)表達(dá),但AKT及GSK3β總蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化。AKT基因敲低后,不僅p-GSK3β表達(dá)減低,而且明顯減輕了瘦素誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能紊亂,包括減少了瘦素誘導(dǎo)的黏附分子表達(dá)、減弱了內(nèi)皮細(xì)胞遷移及透通性,并改善了 F-actin細(xì)胞骨架紊亂。2.5.2瘦素通過(guò)誘導(dǎo)β-catenin核聚集參與內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂:與正常對(duì)照組相比,瘦素刺激組β-catenin核蛋白表達(dá)明顯增加。β-cateninshRNA病毒轉(zhuǎn)染明顯抑制了瘦素誘導(dǎo)的黏附分子合成及細(xì)胞骨架重構(gòu)。此外,β-catenin病毒轉(zhuǎn)染也明顯減弱了瘦素誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移及透通性改變。我們進(jìn)一步檢測(cè)了 AKT shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)β-catenin核轉(zhuǎn)位的影響,western blot結(jié)果顯示,AKT基因敲除明顯減少了瘦素誘導(dǎo)的β-catenin核蛋白的表達(dá)。結(jié)論1.慢性腎臟病患者血清瘦素水平升高,且與內(nèi)皮功能紊亂存在相關(guān)性。2.體外實(shí)驗(yàn)中,瘦素可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子合成增加、內(nèi)皮細(xì)胞遷移性增強(qiáng)并增加內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性,從而引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。3.瘦素可能通過(guò)活化AKT/GSK3β及β-catenin信號(hào)通路導(dǎo)致F-actin細(xì)胞骨架重排,從而增加內(nèi)皮細(xì)胞遷移和內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性,最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Leptin: a multifunctional hormone[J];Cell Research;2000年02期

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本文編號(hào)：1266444