本文關鍵詞：微流控肝小葉樣三維微組織仿生構筑

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【摘要】：肝臟是人體最大的內(nèi)臟器官,發(fā)揮著諸多重要功能,如代謝、合成、免疫和解毒等。肝組織工程,由來自兩個方面的需求驅(qū)動,在過去的三十年間經(jīng)歷了快速發(fā)展。第一個方面來自臨床上肝臟移植。肝移植是治療終末期肝衰竭等肝臟疾病的唯一的有效手段。然而,肝移植治療手段受制于肝供體的短缺、移植后的免疫排斥和移植耗費巨大等問題。這些情況使得體外構建功能性肝組織移植體尤為重要。另一方面,當前藥物開發(fā)過程中,藥物誘導肝損傷是難以預料的不良反應,導致藥物開發(fā)效率低下、成本提升。當前,醫(yī)藥企業(yè)依賴于二維肝細胞培養(yǎng)模型和實驗動物模型進行體外和體內(nèi)藥物分析。然而,二維細胞模型難以再現(xiàn)體內(nèi)肝臟的三維生理微環(huán)境;實驗動物模型具有工作繁重、耗費巨大、動物福利等問題,且與人體在代謝通路上存在物種差異,獲得的結果無法推廣到人體試驗中。因此,醫(yī)藥企業(yè)也迫切尋求優(yōu)勢的體外肝臟模型進行藥物肝毒性的臨床前預篩選,加快藥物篩選進程和提高藥物篩選效率。為了滿足上述需求,本研究提出并驗證了兩種基于微流控芯片技術的策略,實現(xiàn)了肝組織體外工程化構筑。簡言之:策略一構建了肝小葉樣肝臟芯片,并將其應用于藥物肝毒性和藥物-藥物相互作用誘導的不良反應分析;策略二研發(fā)了氣動輔助微模塑方法,實現(xiàn)了肝小葉樣載細胞微凝膠的制備。本研究的完成為體外藥物肝毒性分析提供了模型支持,同時也為多尺度的肝組織工程技術的發(fā)展提供了新的思路。本論文所得到的研究結果如下:1.本研究利用AutoCAD軟件設計了一種模擬肝小葉的多層微流控芯片,并結合光刻技術和多層軟蝕刻技術制備了符合設計的仿生微流控芯片。自上而下觀察,該芯片具有四層結構,分別為流動層、控制層、支持層和載玻片層。其中,流動層具有細胞培養(yǎng)微腔室,腔室內(nèi)分布有多重微柱陣列;控制層集成有氣動控制系統(tǒng),用于實現(xiàn)肝細胞和內(nèi)皮細胞的共定位和區(qū)域化接種。通過對芯片加工過程中流動層與控制層的鍵合時間的探索,本研究制備出了具有結構完整、性能良好、層與層之間緊密粘合的集成仿生微流控芯片。不同壓力驅(qū)動試驗顯示18 psi可以實現(xiàn)氣動控制系統(tǒng)的成功運行,為后續(xù)構建肝小葉樣肝臟芯片提供了關鍵參數(shù)。2.本研究通過順序灌注肝細胞(HepG2)和內(nèi)皮細胞(Human Aortic Endothelial Cells,HAECs)及程序化操作氣動控制系統(tǒng)實現(xiàn)了肝臟芯片的成功構建。共聚焦圖像顯示,本研究所構建的肝臟芯片具有肝小葉樣的組織形態(tài),即HepG2細胞形成的肝細胞索樣結構和HAEC細胞形成的肝血竇樣結構。肝代謝酶活力分析顯示,肝小葉樣肝臟芯片具有較高的基礎CYP-1A1/2和UGT酶活力,同時動態(tài)應答于CYP-1A1/2和UGT酶的誘導劑和抑制劑。藥物毒性測試結果顯示,肝小葉樣肝臟芯片較好地響應于不同藥物誘導的肝毒性,提示該芯片具有較高的藥物代謝能力。3.應用肝小葉樣肝臟芯片,本研究成功地分析了由不同藥物組合間的相互作用誘導產(chǎn)生的肝毒性。預先使用可誘導或抑制CYP-1A1/2和UGT酶活力的藥物處理肝臟芯片,之后使用另一種藥物再次處理,結果顯示后施加藥物的肝毒性受到了前施加藥物的影響。這些結果提示肝小葉樣肝臟芯片可以為臨床前的藥物不良反應分析提供體外肝組織模型。4.作為本論文的另一部分,本研究提出了一種新型的載細胞微凝膠的制備方法,稱作氣動輔助微模塑(Pneumatic-aided micro-molding,PAM)。氣動輔助微模塑利用微流控芯片中預先設計的微閥門實現(xiàn)限制區(qū)域內(nèi)的凝膠固化,進而實現(xiàn)載細胞凝膠的可控制備。應用該方法,本研究實現(xiàn)了具有多種幾何形狀(三角形、正方形和圓形)的、包裹不同細胞類型(HepG2細胞、NIH 3T3成纖維細胞和A549細胞)的、不同凝膠種類(膠原、明膠和瓊脂)的微凝膠的可控制備。本研究通過調(diào)整微閥門的結構設計,實現(xiàn)了微凝膠中單個或多個特定形狀微通道的整合以及多個微通道的特定布局。此外,使用微閥門系統(tǒng)實現(xiàn)兩步氣動輔助微模塑過程,本研究也成功地制備了包裹不同細胞種類的多組分或多區(qū)隔化的微凝膠。5.本研究構建了集成有氣動輔助微模塑功能的微流控芯片,實現(xiàn)了肝小葉樣載細胞微凝膠的制備。形態(tài)學觀察顯示,載細胞微凝膠呈現(xiàn)出肝小葉樣的組織形態(tài),即肝細胞(HepG2)為條索狀分布,而內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell-C,HUVEC-C)與肝細胞間隔分布�；诟涡∪~樣微組織,本研究分析了撲熱息痛的肝毒性和谷胱甘肽的肝保護作用。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R318
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本文編號：1262132