本文關(guān)鍵詞：微流控肝小葉樣三維微組織仿生構(gòu)筑

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【摘要】：肝臟是人體最大的內(nèi)臟器官,發(fā)揮著諸多重要功能,如代謝、合成、免疫和解毒等。肝組織工程,由來(lái)自兩個(gè)方面的需求驅(qū)動(dòng),在過去的三十年間經(jīng)歷了快速發(fā)展。第一個(gè)方面來(lái)自臨床上肝臟移植。肝移植是治療終末期肝衰竭等肝臟疾病的唯一的有效手段。然而,肝移植治療手段受制于肝供體的短缺、移植后的免疫排斥和移植耗費(fèi)巨大等問題。這些情況使得體外構(gòu)建功能性肝組織移植體尤為重要。另一方面,當(dāng)前藥物開發(fā)過程中,藥物誘導(dǎo)肝損傷是難以預(yù)料的不良反應(yīng),導(dǎo)致藥物開發(fā)效率低下、成本提升。當(dāng)前,醫(yī)藥企業(yè)依賴于二維肝細(xì)胞培養(yǎng)模型和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行體外和體內(nèi)藥物分析。然而,二維細(xì)胞模型難以再現(xiàn)體內(nèi)肝臟的三維生理微環(huán)境;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型具有工作繁重、耗費(fèi)巨大、動(dòng)物福利等問題,且與人體在代謝通路上存在物種差異,獲得的結(jié)果無(wú)法推廣到人體試驗(yàn)中。因此,醫(yī)藥企業(yè)也迫切尋求優(yōu)勢(shì)的體外肝臟模型進(jìn)行藥物肝毒性的臨床前預(yù)篩選,加快藥物篩選進(jìn)程和提高藥物篩選效率。為了滿足上述需求,本研究提出并驗(yàn)證了兩種基于微流控芯片技術(shù)的策略,實(shí)現(xiàn)了肝組織體外工程化構(gòu)筑。簡(jiǎn)言之:策略一構(gòu)建了肝小葉樣肝臟芯片,并將其應(yīng)用于藥物肝毒性和藥物-藥物相互作用誘導(dǎo)的不良反應(yīng)分析;策略二研發(fā)了氣動(dòng)輔助微模塑方法,實(shí)現(xiàn)了肝小葉樣載細(xì)胞微凝膠的制備。本研究的完成為體外藥物肝毒性分析提供了模型支持,同時(shí)也為多尺度的肝組織工程技術(shù)的發(fā)展提供了新的思路。本論文所得到的研究結(jié)果如下:1.本研究利用AutoCAD軟件設(shè)計(jì)了一種模擬肝小葉的多層微流控芯片,并結(jié)合光刻技術(shù)和多層軟蝕刻技術(shù)制備了符合設(shè)計(jì)的仿生微流控芯片。自上而下觀察,該芯片具有四層結(jié)構(gòu),分別為流動(dòng)層、控制層、支持層和載玻片層。其中,流動(dòng)層具有細(xì)胞培養(yǎng)微腔室,腔室內(nèi)分布有多重微柱陣列;控制層集成有氣動(dòng)控制系統(tǒng),用于實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的共定位和區(qū)域化接種。通過對(duì)芯片加工過程中流動(dòng)層與控制層的鍵合時(shí)間的探索,本研究制備出了具有結(jié)構(gòu)完整、性能良好、層與層之間緊密粘合的集成仿生微流控芯片。不同壓力驅(qū)動(dòng)試驗(yàn)顯示18 psi可以實(shí)現(xiàn)氣動(dòng)控制系統(tǒng)的成功運(yùn)行,為后續(xù)構(gòu)建肝小葉樣肝臟芯片提供了關(guān)鍵參數(shù)。2.本研究通過順序灌注肝細(xì)胞(HepG2)和內(nèi)皮細(xì)胞(Human Aortic Endothelial Cells,HAECs)及程序化操作氣動(dòng)控制系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了肝臟芯片的成功構(gòu)建。共聚焦圖像顯示,本研究所構(gòu)建的肝臟芯片具有肝小葉樣的組織形態(tài),即HepG2細(xì)胞形成的肝細(xì)胞索樣結(jié)構(gòu)和HAEC細(xì)胞形成的肝血竇樣結(jié)構(gòu)。肝代謝酶活力分析顯示,肝小葉樣肝臟芯片具有較高的基礎(chǔ)CYP-1A1/2和UGT酶活力,同時(shí)動(dòng)態(tài)應(yīng)答于CYP-1A1/2和UGT酶的誘導(dǎo)劑和抑制劑。藥物毒性測(cè)試結(jié)果顯示,肝小葉樣肝臟芯片較好地響應(yīng)于不同藥物誘導(dǎo)的肝毒性,提示該芯片具有較高的藥物代謝能力。3.應(yīng)用肝小葉樣肝臟芯片,本研究成功地分析了由不同藥物組合間的相互作用誘導(dǎo)產(chǎn)生的肝毒性。預(yù)先使用可誘導(dǎo)或抑制CYP-1A1/2和UGT酶活力的藥物處理肝臟芯片,之后使用另一種藥物再次處理,結(jié)果顯示后施加藥物的肝毒性受到了前施加藥物的影響。這些結(jié)果提示肝小葉樣肝臟芯片可以為臨床前的藥物不良反應(yīng)分析提供體外肝組織模型。4.作為本論文的另一部分,本研究提出了一種新型的載細(xì)胞微凝膠的制備方法,稱作氣動(dòng)輔助微模塑(Pneumatic-aided micro-molding,PAM)。氣動(dòng)輔助微模塑利用微流控芯片中預(yù)先設(shè)計(jì)的微閥門實(shí)現(xiàn)限制區(qū)域內(nèi)的凝膠固化,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)載細(xì)胞凝膠的可控制備。應(yīng)用該方法,本研究實(shí)現(xiàn)了具有多種幾何形狀(三角形、正方形和圓形)的、包裹不同細(xì)胞類型(HepG2細(xì)胞、NIH 3T3成纖維細(xì)胞和A549細(xì)胞)的、不同凝膠種類(膠原、明膠和瓊脂)的微凝膠的可控制備。本研究通過調(diào)整微閥門的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì),實(shí)現(xiàn)了微凝膠中單個(gè)或多個(gè)特定形狀微通道的整合以及多個(gè)微通道的特定布局。此外,使用微閥門系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)兩步氣動(dòng)輔助微模塑過程,本研究也成功地制備了包裹不同細(xì)胞種類的多組分或多區(qū)隔化的微凝膠。5.本研究構(gòu)建了集成有氣動(dòng)輔助微模塑功能的微流控芯片,實(shí)現(xiàn)了肝小葉樣載細(xì)胞微凝膠的制備。形態(tài)學(xué)觀察顯示,載細(xì)胞微凝膠呈現(xiàn)出肝小葉樣的組織形態(tài),即肝細(xì)胞(HepG2)為條索狀分布,而內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell-C,HUVEC-C)與肝細(xì)胞間隔分布�；诟涡∪~樣微組織,本研究分析了撲熱息痛的肝毒性和谷胱甘肽的肝保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R318
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本文編號(hào)：1262132