本文關鍵詞：胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露模型的建立及相關神經毒性研究

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【摘要】：研究背景近10年來,臨床回顧性分析研究已經證實,新生兒及嬰幼兒早期接受全身麻醉和鎮(zhèn)靜,可引起隨后的神經系統(tǒng)功能障礙,包括學習能力下降、認知功能減弱等。這一結果,不僅引起醫(yī)療專家的關注,也引起了管理者和患兒家長的廣泛重視。尤其,隨著孕期婦女非產科手術比例的增加(0.15%-2%),全身麻醉是否會影響胎兒神經系統(tǒng)的發(fā)育,導致出生后的神經系統(tǒng)功能障礙,成為臨床麻醉關注的熱點問題。靜脈麻醉藥物丙泊酚(又名異丙酚,英文名稱Propofol,化學名2,6-二異丙基苯酚)因起效迅速、代謝快而完全、蘇醒快而平穩(wěn)、不良反應少等優(yōu)點被廣泛應用于各類手術的全麻誘導和維持中,尤其適用于嬰幼兒手術麻醉、氣管插管、內鏡檢查等操作和ICU的鎮(zhèn)靜。然而,與其他麻醉藥物的神經毒性作用相似,研究發(fā)現(xiàn),早期接觸丙泊酚也可引起發(fā)育中大腦廣泛的神經元細胞凋亡,導致長期的神經系統(tǒng)功能障礙,如學習、認知能力下降。進一步研究還證實,丙泊酚可影響突觸的形成過程,通過影響樹突棘的形態(tài)和濃度,突觸結構的數(shù)量來改變神經信號的傳導,最終導致神經系統(tǒng)發(fā)育畸形,出現(xiàn)行為的異常。突觸的形成是由多種基因、蛋白質參與的復雜的生理過程。其中mbp和synapsin Ha (syn2a)基因在突觸的形成過程中發(fā)揮重要作用。Abp基因通過轉錄、翻譯,編碼形成鞘磷脂蛋白(Myelin basic protein, Mbp)。Mbp是少突膠質細胞特異性表達的一種蛋白,其圍繞神經元的軸突形成髓鞘,是保證神經信號快速、單向傳導的重要結構。如果Mbp蛋白表達異常,導致髓鞘的形成受到損害、減少甚至缺失,不僅會影響神經信號的傳遞,也會導致硬化相關性疾病的發(fā)生,主要表現(xiàn)為認知功能的障礙、語言、視力減弱、震顫、肌痙攣等。Syn2a基因是調節(jié)突觸結構形成的基因,其表達的異常會直接影響突觸結構的形態(tài)及數(shù)量。然而,目前關于丙泊酚對mbp和syn2a基因及蛋白表達影響的研究較少,尤其是胚胎期丙泊酚暴露,是否會通過影響mbp、syn2a基因和蛋白的表達導致神經系統(tǒng)發(fā)育障礙?為解決這一疑問,需要更多的研究探討丙泊酚暴露對mbp和syn2a基因及蛋白表達的影響及相關的分子機制。研究發(fā)現(xiàn),丙泊酚的神經毒性作用具有時間依賴性,即在突觸發(fā)育的關鍵時期(相當于嚙齒類動物出生后7-14天左右)最為敏感。因此,目前相關的實驗動物均選取出生后7-15天的幼鼠。那么,對于神經發(fā)育的起始階段-胚胎期,神經干細胞向各級神經元分化、遷移、增殖的重要時期,是否對丙泊酚更加敏感?在此期間接受丙泊酚暴露是否會影響胚胎發(fā)育?是否會誘導細胞的凋亡甚至影響mbp和syn2a基因及蛋白的表達呢?探討這一系列問題具有重要的研究價值和意義。這不僅是丙泊酚神經毒性研究在作用時間上的擴展,更是機制研究的深入。由于哺乳動物胚胎宮內發(fā)育的特點,目前較少有丙泊酚對活體胚胎期生物神經系統(tǒng)發(fā)育影響的文獻報道,因此,需要建立新的動物模型,探討胚胎期丙泊酚暴露的神經毒性作用。斑馬魚的出現(xiàn),解決了哺乳類動物無法解決的問題。斑馬魚做為一種新型模式動物,因其胚胎體外受精、體外發(fā)育,且胚胎透明、易于觀察與操作等特點,已廣泛應用于神經發(fā)育、神經損傷和神經行為學等神經科學研究。尤其斑馬魚胚胎透明,易于觀察與操作等優(yōu)勢,已成為篩查藥物胚胎期神經毒性的首選模式動物。通過免疫熒光、熒光探針、活體成像等技術可直接觀察活體動物體內細胞或蛋白表達的變化。更值得一提的是,斑馬魚因繁殖周期短,生產量等優(yōu)勢,不僅降低了構建轉基因魚的技術難度,還大大縮短了時間和經濟成本。因此,憑借斑馬魚模式動物的諸多優(yōu)勢,本研究通過建立胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露模型,探討胚胎期丙泊酚暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育的神經毒性作用,包括對胚胎發(fā)育生存率、孵化率和畸形率的影響；對胚胎細胞凋亡的影響及對mbp和syn2a基因及蛋白表達的影響。研究成果,不僅能為基礎研究提供新的理論依據(jù),更重要的是可為臨床應用提供重要參考,為如何安全有效的開展孕婦及新生兒、嬰幼兒麻醉工作,提供科學依據(jù)。研究目的1.建立胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露模型；2.探討胚胎期丙泊酚暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育過程中生存率、孵化率和畸形率的影響及對7dpf幼魚腦組織結構的影響；3.探討胚胎期丙泊酚暴露對斑馬魚胚胎及幼魚細胞凋亡的影響及相關的分子制：4.探討胚胎期丙泊酚暴露對斑馬魚mbp和syn2a基因及蛋白表達的響。研究內容與方法1.建立胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露模型目前,尚無采用斑馬魚研究丙泊酚神經毒性作用的相關文獻報道,因此,本研究的第一部分內容是建立斑馬魚胚胎丙泊酚暴露模型。以受精后的斑馬魚胚胎和幼魚為研究對象,通過檢測不同時間和不同濃度丙泊酚暴露下,胚胎發(fā)育孵化率、畸形率和生存率的變化來確定合理的暴露濃度和時間。具體內容如下：1)為確定斑馬魚胚胎丙泊酚暴露濃度和暴露時間,將受精后6-48小時(6-48hpf,hours post-fertilization)的胚胎浸泡于含不同濃度丙泊酚(1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、9μg/ml)和含相同劑量DMSO(丙泊酚溶劑,0.013%)及空白對照幼魚孵化水中。24hpf時將各組受試液均更新一半(含丙泊酚和DMSO溶液),48hpf全部更換為孵化水。2)為檢測胚胎期丙泊酚暴露的一般毒性作用,分別在24、48、72、96和120hpf時,記錄各實驗組胚胎生存率、孵化率、畸形率以及畸形特征。3)為檢測胚胎期丙泊酚暴露對腦部發(fā)育的影響,取暴露后7dpf (days post-fertilization)幼魚,通過HE染色檢測其腦部細胞數(shù)量和腦室腔的變化。4)為檢測丙泊酚的麻醉效果,取健康6dpf幼魚分別浸泡于含不同濃度丙泊酚(1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml)、含相同劑量DMSO(0.013%)及空白對照養(yǎng)魚水中,浸泡30min后全部更換為新鮮養(yǎng)魚水,觀察24h。通過記錄各組幼魚麻醉起效時間、復蘇時間及死亡率來評價丙泊酚的麻醉效應。2.檢測胚胎期丙泊酚暴露的神經毒性作用哺乳類動物實驗研究已經證實,出生后早期丙泊酚暴露可以引起發(fā)育中大腦廣泛的神經細胞凋亡。因此,胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露模型建立成功后,第二部分研究內容就是檢測胚胎期丙泊酚暴露對細胞凋亡的影響及可能的分子機制。同時,進一步探討了胚胎期丙泊酚暴露對mbp和syn2a基因及蛋白表達的影響。具體內容如下：1)為檢測胚胎期丙泊酚暴露的促細胞凋亡作用,取暴露后36hpf胚胎,通過整體吖啶橙染色,比較各組胚胎整體凋亡細胞數(shù)量的變化。2)為檢測丙泊酚促細胞凋亡作用的機制,取暴露后36hpf胚胎,通過qRT-PCR檢測凋亡信號傳導通路相關基因caspase-3、caspase-8和caspase-9 mRNA表達的變化。3)為檢測丙泊酚對孵化后幼魚的神經毒性作用,取經暴露后3dpf幼魚,通過整體吖啶橙染色,比較各組幼魚腦部凋亡細胞的變化。4)為檢測丙泊酚對孵化后幼魚的神經毒性作用,取經暴露后3dpf幼魚,通過qRT-PCR、整體原位雜交技術和western blots法,分析mbp和syn2a基因及蛋白表達的變化。研究結果1.1、2、3μg/ml丙泊酚是研究胚胎期丙泊酚神經毒性作用的最佳濃度將6-48hpf斑馬魚胚胎浸泡于含不同濃度丙泊酚、DMSO和空白對照幼魚孵化水中發(fā)現(xiàn),在1、2、3μg/ml丙泊酚暴露組,從24hpf至120hpf,胚胎發(fā)育的生存率均高于93%,與空白對照組和DMSO組比較,無顯著性差異。DMSO組與空白對照組比較,各時間點生存率也無顯著差異。然而,在4、6、9μg/ml丙泊酚暴露組,胚胎及幼魚的生存率顯著下降(P0.05),且分別在96hpf (6μg/ml丙泊酚組)和48hpf (9μg/ml丙泊酚組)全部死亡。比較各實驗組胚胎孵化率發(fā)現(xiàn),與空白對照組和DMSO組比較,1、2、3μg/ml丙泊酚暴露組的胚胎孵化率在48hpf (P0.05)和72hpf (P0.05)均顯著降低；DMSO組與空白對照組相比,無顯著性差異(P0.05)。比較各實驗組5dpf幼魚畸形率也發(fā)現(xiàn),丙泊酚暴露組畸形率顯著增高(P0.05)；DMSO組與空白對照組相比,無顯著差異(P0.05)。幼魚的畸形主要表現(xiàn)為：心包囊腫、脊柱彎曲、眼睛變小和出血等。以上結果顯示,胚胎期1、2、3μg/ml丙泊酚暴露對胚胎發(fā)育具有毒性作用,表現(xiàn)為延緩胚胎孵化率,增加胚胎發(fā)育的畸形率。但在此濃度暴露下的斑馬魚從胚胎到幼魚,生存率均無顯著變化,提示1、2、3μg/ml丙泊酚是探討胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露神經毒性作用的最佳濃度。2.1、2、3μg/ml丙泊酚具有麻醉效果由于斑馬魚體積較小,無法精確測量經浸泡后幼魚體內丙泊酚的血藥濃度。為檢測該濃度下丙泊酚的麻醉效應,將6dpf幼魚浸泡于含不同濃度丙泊酚、DMSO及空白對照養(yǎng)魚水中30min。對針尖觸碰魚尾無反應,且無自主運動能力的幼魚被認為進入麻醉狀態(tài)。結果顯示,在1、2、3μg/ml丙泊酚組,各組幼魚均在90s內進入麻醉狀態(tài),平均時間(s)分別為60(45,75)、45(30,60)、30(30,45),空白對照組和DMSO組幼魚均可自由游動。麻醉30min后,各組幼魚復蘇時間從60min-150min不等,平均時間(min)分別為75(75,90)、120(105,120)、120(120,135)。麻醉及復蘇后24h內,無幼魚死亡。綜上所述,1、2、3μg/ml丙泊酚是研究胚胎期丙泊酚暴露神經毒性作用的最佳濃度,不僅對胚胎發(fā)育具有一定毒性作用,而且對幼魚具有臨床麻醉效應,符合研究藥物毒性作用的實驗要求。3.丙泊酚可影響7dp坳魚腦組織結構比較經胚胎期1、2、3μg/ml丙泊酚暴露,發(fā)育至7dpf幼魚的腦部組織結構可見,與對照組相比,丙泊酚處理組幼魚腦組織結構腔隙增大,細胞數(shù)量減少。提示,胚胎期丙泊酚暴露對斑馬魚腦部發(fā)育具有毒性作用。4.丙泊酚可誘導36hpf胚胎細胞凋亡增加,上調‘caspase-3、-8和-9mRNA表達研究已經證實,丙泊酚可引起發(fā)育中大腦廣泛的神經元細胞凋亡,那么對于斑馬魚是否具有相同的作用呢?本研究顯示：在對照組中,36hpf胚胎整體未見明顯的凋亡細胞信號；在1、2、3μg/ml丙泊酚組,在胚胎頭部、尾部均可見凋亡細胞,數(shù)量明顯增多。Caspase家族參與的信號傳導通路是啟動細胞凋亡程序的重要機制之一,其中caspase-3、caspase-8和caspase-9在此過程中發(fā)揮關鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,丙泊酚暴露組胚胎體內caspase-3、-8、-PmRNA表達均顯著增高(P0.05)。進一步分析還發(fā)現(xiàn),caspase-8和caspase-9在三個劑量丙泊酚暴露組的表達呈劑量依賴性上調(P0.05)。以上結果提示,胚胎期丙泊酚暴露引起的促細胞凋亡作用可能與caspase信號通路的激活有關,且丙泊酚的神經毒性作用隨著藥物濃度的增高而增強。5.丙泊酚可誘導3dpf幼魚腦部細胞凋亡增多3dpf是斑馬魚胚胎孵化為幼魚的關鍵時期,為檢測丙泊酚促細胞凋亡作用的持續(xù)性,本研究分析了3dpf幼魚腦組織中凋亡細胞數(shù)量的變化。結果顯示,與對照相比,丙泊酚暴露組腦部凋亡細胞的數(shù)量顯著增多(P0.05)。并且,3μg/ml丙泊酚暴露組腦部凋亡細胞數(shù)量高于1μg/m1丙泊酚暴露組(P0.05)。提示丙泊酚的促細胞凋亡作用具有持續(xù)性,且隨著藥物濃度的增高而增強。6.丙泊酚可下調mbp mRNA及蛋白的表達Mbp和syn2a基因是突觸形成過程中發(fā)揮重要作用的兩種基因。然而,目前很少有研究探討丙泊酚對此兩種基因表達的影響。本研究發(fā)現(xiàn),經胚胎期1、2、3μg/ml丙泊酚暴露后,各組3dp坳魚mbp mRNA表達顯著下降(P0.05)。通過整體原位雜交法發(fā)現(xiàn),mbp mRNA下調程度可分為三個級別：無變化、輕度下降和嚴重下降。整體原位雜交結果還顯示,mbp mRNA表達的下降主要表現(xiàn)在中樞神經系統(tǒng),外周神經系統(tǒng)的表達無顯著差異。Mbp蛋白檢測也顯示一致結果,與對照組相比,丙泊酚暴露組幼魚Mbp蛋白的表達呈劑量依賴性下降(P0.05)。然而,分析發(fā)現(xiàn),與對照組相比,丙泊酚暴露組幼魚syn2a基因mRNA的表達無顯著差異(P0.05)。結論1.將6-48hpf斑馬魚胚胎通過浸泡方式暴露于含1、2、3μg/ml丙泊酚幼魚孵化水中,是研究胚胎期丙泊酚暴露神經毒性作用的最佳動物模型；2.胚胎期丙泊酚暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育具有毒性作用,表現(xiàn)為：延遲胚胎孵化的時間,引起胚胎發(fā)育的畸形及影響腦組織結構的正常發(fā)育；3.胚胎期丙泊酚暴露可引起胚胎整體細胞凋亡增多,且細胞凋亡的發(fā)生可能與caspase-3、-8、-9參與的信號通路的激活有關。4.胚胎期丙泊酚暴露的神經毒性作用具有持久性,在暴露后24h,丙泊酚仍可誘導幼魚腦部細胞凋亡增加,且明顯抑制mbp基因mRNA和蛋白的表達。
【關鍵詞】：丙泊酚 斑馬魚胚胎 細胞凋亡 Myelin basic protein Synapsin Ⅱa
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R-332;R714.5
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-30
• 第一章 胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露模型的建立30-47
• 引言30
• 1 材料與方法30-35
• 2 統(tǒng)計分析35-36
• 3 結果36-43
• 4 討論43-47
• 第二章 胚胎期丙泊酚暴露對斑馬魚神經毒性作用研究47-79
• 引言47
• 1 材料與方法47-65
• 2 統(tǒng)計分析65
• 3 結果65-72
• 4 討論72-79
• 全文總結79-82
• 參考文獻82-95
• 綜述95-110
• 參考文獻103-110
• 中英文縮寫對照表110-111
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文111-112
• 致謝112-114
• 統(tǒng)計學證明114

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本文編號：1085905