基于液相生物芯片的流式分析技術(shù)是一種以微球作為反應(yīng)載體的新型分析技術(shù),可以實現(xiàn)對一種到數(shù)百種生物分子的高靈敏定量檢測,在生物、醫(yī)學(xué)、環(huán)境等基礎(chǔ)和應(yīng)用研究領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。因此,發(fā)展一種環(huán)境友好、操作簡單、低成本的方法用以制備大量性能優(yōu)良、高度均一的功能微球并用于液相生物芯片分析在基礎(chǔ)研究和實際應(yīng)用中具有十分重要的應(yīng)用價值和研究意義。本論文提出了兩種基于單細胞微生物的功能微球的制備方案,并成功將制備的微生物@納米材料復(fù)合功能微球分別應(yīng)用于生物分子的分析測定。一、我們提出了一種采用酵母細胞制備功能微球的新策略,該方法具有簡單、快速、廉價、環(huán)境友好等優(yōu)點。研究結(jié)果表明:甲醛和處理緩沖液處理后的酵母細胞顯示出良好的機械性能,其表面的巰基含量和介孔孔徑都顯著增加。膠體金可以在5 min內(nèi)快速地自組裝到酵母微球（yeast-based microspheres,YMs）表面,形成具有高度單分散性和均一性的新型剛性酵母@膠體金（yeast@Au）微球;通過多種表征方法（如TEM、SEM、EDX、HR-TEM、AFM、熒光顯微鏡、氮氣吸附-脫附等溫實驗、自動電位滴定、XRD、FTIR、Raman... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：150 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

流式細胞儀示意圖

單細胞微生物@納米材料復(fù)合微球用于液相生物芯片的研究3以輕松滿足上述所有要求并具有統(tǒng)計數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和使用便捷性的優(yōu)勢。但是，設(shè)計用于分析真核細胞的常規(guī)流式細胞儀難以提供足夠的靈敏度來分析納米級的BPOs，而高靈敏度流式細胞儀（如納米流式細胞儀，圖1-2）使得對納米級的BPOs進行精確、靈敏和特異性分析成為可能。納米流式細胞儀的高靈敏度也為表征單個細菌的眾多生化特性提供了絕佳機會，而這些特性很難使用常規(guī)流式細胞儀進行分析。隨著納米流式細胞儀的發(fā)展，它可以分別檢測單個病毒以及小至27nm和40nm的外泌體，由此可以預(yù)見其在納米級BPOs分析中有著廣闊的應(yīng)用前景。圖1-2納米流式細胞儀及其應(yīng)用Fig.1-2Nano-flowcytometeranditsapplications(Lianetal.2019)1.1.4成像流式細胞術(shù)成像流式細胞術(shù)（imagingflowcytometry,IFC）是將傳統(tǒng)流式細胞術(shù)（零空間分辨率）的高通量、多參數(shù)功能與形態(tài)學(xué)和空間信息結(jié)合在一起，并且把這些參數(shù)都以單細胞分辨率實現(xiàn)的一種新型的流式細胞術(shù)。它可以在數(shù)分鐘內(nèi)通過CCD相機捕獲成千上萬個單細胞的多通道數(shù)字圖像（圖1-3）(Doanetal.2018)，其中包括幾個熒光通道以及亮場（透射光）和暗場（散射光）。成像流式細胞儀的通量意味著它特別適合分析稀有細胞類型，例如循環(huán)腫瘤細胞(Ogleetal.2016)和過度狀態(tài)的細胞（如細胞周期）(Blasietal.2016)。通過從這些數(shù)字圖像中提取信息（圖1-3，中間圖），成像流式細胞儀可以量化多個亞細胞區(qū)室（細胞核、線粒體等）中目標(biāo)成分（包括蛋白質(zhì)、核酸和糖脂）的多種特性。豐富的信息使成像流式細胞儀成為高內(nèi)涵分析的理想選擇，從而提高了分析復(fù)雜細胞表型、識別稀有細胞和過度狀態(tài)的細胞的可能性，此外，這種新技術(shù)有利于發(fā)現(xiàn)可用于藥物開發(fā)、疾病診斷和個性化

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆博士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文4圖1-3成像流式細胞儀高通量采集單個細胞的圖像Fig.1-3Imagingflowcytometryacquiresimagesofsinglecellsinhighthroughput(Doanetal.2018)1.1.5質(zhì)量流式細胞術(shù)質(zhì)量流式細胞術(shù)，又稱作飛行時間質(zhì)量流式細胞術(shù)，是利用質(zhì)譜技術(shù)檢測細胞內(nèi)外結(jié)合的金屬偶聯(lián)抗體的新一代流式細胞術(shù)平臺(Bendalletal.2012,SpitzerandNolan2016)。傳統(tǒng)流式細胞術(shù)的缺點是對熒光染料的依賴，當(dāng)在一個細胞上使用太多的熒光染料時，可能會導(dǎo)致其分辨率下降或者熒光光譜重疊。為了克服這個問題，可以結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，即細胞被含有不同稀有鑭系金屬的抗體標(biāo)記，然后在等離子體中蒸發(fā)，并且通過飛行時間質(zhì)譜分析每個細胞的金屬信號。離子越重，擊中檢測器所需的時間越長（圖1-4）。通過這種方法，理論上可以在單個細胞分辨率下同時使用約40種可區(qū)分的標(biāo)記。該技術(shù)克服了與熒光染料標(biāo)記相關(guān)的潛在不利問題，尤其是當(dāng)細胞在常規(guī)流式細胞術(shù)中顯示出強烈的自發(fā)熒光時。然而，質(zhì)量流式細胞術(shù)存在的一些缺點現(xiàn)在了其應(yīng)用范圍，其一是質(zhì)量流式細胞儀上沒有配備前向或側(cè)向散射光裝置來確定細胞的大小或粒度；其二是該技術(shù)對抗體特異性、樣品的處理以及同位素標(biāo)記抗體的質(zhì)量等要求較高。

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3291895