【摘要】：電化學(xué)生物傳感器具有簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高等優(yōu)勢(shì),被廣泛應(yīng)于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品分析和病原微生物研究等領(lǐng)域。在電化學(xué)生物傳感器研究構(gòu)建時(shí),利用多功能的納米材料和高效的信號(hào)放大策略改善電化學(xué)生物傳感器的各項(xiàng)性能,這些新方法和新技術(shù)的研發(fā),對(duì)各種生物分子特異、靈敏的檢測(cè)具有十分重要的科學(xué)意義和使用價(jià)值。本論文設(shè)計(jì)多種引入信標(biāo)物質(zhì)的方法,結(jié)合多種信號(hào)放大策略和多功能化納米材料,分別制備了高通量、高靈敏、操作簡(jiǎn)便及生物相容性好的幾種電化學(xué)生物傳感器。具體的工作如下:1.結(jié)合多標(biāo)記多組分檢測(cè)策略和設(shè)計(jì)新的陣列電極構(gòu)建高通量電化學(xué)免疫傳感器的研究多標(biāo)記策略可以實(shí)現(xiàn)傳感器同一界面的多組分同時(shí)測(cè)定,但是這種方法受到了標(biāo)記電活性物質(zhì)數(shù)量的限制,從而限制了傳感器的檢測(cè)通量。為了提高傳感器的檢測(cè)通量,本研究將多標(biāo)記多組分檢測(cè)策略與陣列電極多組分檢測(cè)方法相結(jié)合,構(gòu)建了高通量電化學(xué)免疫傳感器,達(dá)到同時(shí)對(duì)肝癌六種標(biāo)志物的檢測(cè)。在本研究中,新設(shè)計(jì)的陣列電極由三個(gè)檢測(cè)點(diǎn)和一個(gè)對(duì)照檢測(cè)點(diǎn)組成。首先,在每一個(gè)檢測(cè)點(diǎn)上同時(shí)固載兩種不同抗原的一抗,所對(duì)應(yīng)的二抗分別標(biāo)記了兩種具有不同氧化還原電位的電活性物質(zhì)。在夾心免疫反應(yīng)作用下,可以通過(guò)兩種電活性物質(zhì)電流峰位置的不同和峰值大小對(duì)兩種抗原的濃度進(jìn)行定量。由此,在一個(gè)電極上,三個(gè)分析檢測(cè)點(diǎn)可以同時(shí)完成六種生物標(biāo)志物的檢測(cè),與此同時(shí),對(duì)照檢測(cè)點(diǎn)可以完成空白對(duì)照的測(cè)定。另外,為了提高了傳感器檢測(cè)的靈敏度,合成了Pt Pd雙金屬/石墨烯納米片(Pt Pd-GS)用來(lái)固載二抗和辣根過(guò)氧化物酶(HRP),利用Pt Pd-GS和HRP的協(xié)同催化作用來(lái)增強(qiáng)電流信號(hào)。該方法與傳統(tǒng)陣列分析(每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)上檢測(cè)一種蛋白),檢測(cè)通量增加了一倍。根據(jù)這種檢測(cè)模型,若在同一檢測(cè)點(diǎn)上同時(shí)檢測(cè)三種或四種目標(biāo)物,那么傳感器的檢測(cè)通量可以增加三倍以上。本研究所構(gòu)建的檢測(cè)模型將是一個(gè)新高通量分析物測(cè)定的模型。2.高效蛋白轉(zhuǎn)化策略用于對(duì)胱抑素C的電化學(xué)靈敏檢測(cè)目前,抗體依然是蛋白質(zhì)檢測(cè)中最主要的識(shí)別元件。然而,抗體作為識(shí)別元件大大增加了核酸技術(shù)在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用難度。本研究結(jié)合夾心免疫反應(yīng),鄰位觸及反應(yīng)和酶剪切目標(biāo)循環(huán)策略設(shè)計(jì)了一個(gè)蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)換體系,將蛋白質(zhì)的檢測(cè)轉(zhuǎn)換為DNA的測(cè)定,在進(jìn)行DNA測(cè)定時(shí),再引入了將雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR),從而成功的將HCR應(yīng)用到蛋白質(zhì)檢測(cè)當(dāng)中。在該蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換體系中,一個(gè)目標(biāo)物(如胱抑素C)的輸入可以轉(zhuǎn)換為多個(gè)單鏈DNA的輸出,從而提高了蛋白質(zhì)檢測(cè)的靈敏度。同時(shí),輸出的單鏈DNA再作為引發(fā)DNA在電極表面引發(fā)HCR,使電極表面產(chǎn)生大量的雙鏈DNA聚合物,最后通過(guò)雙鏈DNA聚合物和電活性物質(zhì)硫堇(Thi)之間的靜電吸附的作用,將大量的Thi固載到電極表面,從而輸出可測(cè)的電化學(xué)信號(hào)。通過(guò)電極表面的HCR放大技術(shù),進(jìn)一步的提高了蛋白質(zhì)檢測(cè)的靈敏度。通過(guò)以上設(shè)計(jì),成功的將酶剪切目標(biāo)物循環(huán)和HCR兩種核酸技術(shù)應(yīng)用在蛋白質(zhì)檢測(cè)當(dāng)中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法切實(shí)可行,具有檢測(cè)限低、選擇性好等特點(diǎn)。3.Cu、Mn雙摻雜的二氧化鈰納米球作為信號(hào)標(biāo)簽和信號(hào)放大器構(gòu)建的信號(hào)增強(qiáng)型電化學(xué)生物傳感器電化學(xué)生物傳感器構(gòu)建中電信號(hào)的來(lái)源主要是依賴于具有電化學(xué)活性染料小分子。對(duì)納米材料自身作為信號(hào)標(biāo)簽的關(guān)注還比較少。本研究合成了Cu、Mn雙摻雜的二氧化鈰納米球(CuMn-CeO_2)作為信號(hào)標(biāo)簽、載體和催化劑構(gòu)建了電化學(xué)免疫傳感器用于對(duì)降鈣素原(PCT)的測(cè)定。通過(guò)Cu、Mn雙摻雜的作用,改善了CeO_2本身的電化學(xué)性能,使傳感器的電流信號(hào)直接來(lái)源于CuMn-CeO_2,不需要再引入額外的電活性物質(zhì)作為標(biāo)簽。同時(shí),由于CuMn-CeO_2對(duì)H2O2的氧化具有良好的催化作用,在測(cè)試底液中加入H2O2時(shí),二抗生物耦合物中的CuMn-CeO_2會(huì)催化H2O2氧化的同時(shí)促進(jìn)Ce3+/Ce4+之間的電子傳輸,從而增強(qiáng)了電流信號(hào),提高了檢測(cè)的靈敏度。此外,CuMn-CeO_2不需要再經(jīng)過(guò)其他的化學(xué)修飾就可直接作為載體固載PCT第二抗體。在該研究中,CuMn-CeO_2這種納米材料同時(shí)作為信號(hào)標(biāo)簽、載體和信號(hào)放大器,大大地簡(jiǎn)化了傳感器的構(gòu)建步驟。本研究成功地利用納米材料作為電活性物質(zhì)來(lái)構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器,拓展了納米材料的應(yīng)用范圍。4.基于堿性磷酸酯酶和Hemin/G-四分體催化氧化1-萘酚構(gòu)建的信號(hào)放大型凝血酶適體傳感器的研究文獻(xiàn)報(bào)道堿性磷酸酯酶是一類可以催化不具有電化學(xué)活性的底物水解生成具有電化學(xué)活性的物質(zhì)的生物酶。由此,堿性磷酸酯酶廣泛應(yīng)用在構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器當(dāng)中。同時(shí),這類傳感器還結(jié)合了化學(xué)氧化還原循環(huán)放大策略來(lái)增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)去提高檢測(cè)的靈敏度。這種信號(hào)放大策略是通過(guò)向測(cè)試底液中加入的強(qiáng)還原劑得以實(shí)現(xiàn),但是,強(qiáng)還原劑的引入會(huì)致使堿性磷酸酯酶和生物分子的活性在一定程度上受到影響。本研究提出利用生物相容性好的Hemin/G-四分體作為催化劑,在H2O2存在的情況下,直接高效地催化氧化在電極表面原位產(chǎn)生的電活性物質(zhì)1-萘酚來(lái)構(gòu)建信號(hào)放大型電化學(xué)凝血酶適體傳感器。在該傳感器中,首先利用堿性磷酸酯酶催化水解1-萘酚磷酸酯,在電極表面原位產(chǎn)生了電活性物質(zhì)1-萘酚,從而輸出一個(gè)可測(cè)量的電化學(xué)信號(hào)。在加入H2O2后,Hemin/G-四分體會(huì)高效催化氧化1-萘酚,從而使輸出的電流密度增加。為了進(jìn)一步增強(qiáng)輸出電流,將具有良好導(dǎo)電性的Au納米修飾的ZnO納米花作為載體用于增加生物分子的固載量,為電子傳輸提供良好的微環(huán)境。本研究探究了Hemin/G-四分體的新的催化活性,同時(shí)為基于堿性磷酸酯酶的電化學(xué)傳感器提供了新的信號(hào)放大策略。5.基于DNA水凝膠和pH刺激信號(hào)放大構(gòu)建的電化學(xué)阻抗傳感器的研究電化學(xué)阻抗傳感器一般是基于目標(biāo)物自身阻礙電子傳遞所引起的阻抗變化來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定量測(cè)定,其靈敏度較低。若目標(biāo)物能夠引發(fā)生成一些對(duì)電子傳遞具有更強(qiáng)的阻礙作用的物質(zhì)生成,從而能夠顯著提高檢測(cè)靈敏度。本研究通過(guò)目標(biāo)物誘導(dǎo)形成對(duì)電子傳遞阻礙作用更強(qiáng)的水凝膠生成,再結(jié)合pH刺激增加水凝膠密度的方式來(lái)放大阻抗信號(hào),構(gòu)建了信號(hào)放大型阻抗傳感器用于對(duì)乙酰肝素酶(HPA)的電化學(xué)檢測(cè)。首先,在有目標(biāo)物HPA存在時(shí),HPA將引發(fā)DNA雜交從而在電極表面上形成水凝膠,同時(shí)將HPA包裹在水凝膠中。由于水凝膠和HPA都對(duì)電子傳遞具有阻礙作用,因此,可以得到一個(gè)與HPA濃度相關(guān)的阻抗信號(hào)。此外,在形成的水凝膠中,還設(shè)計(jì)有對(duì)H+有響應(yīng)作用的DNA。當(dāng)改變水凝膠的pH至5.0時(shí),H+將會(huì)誘導(dǎo)所對(duì)應(yīng)的DNA發(fā)生折疊促使水凝膠的密度增加,使水凝膠阻礙電子傳輸?shù)淖饔眠M(jìn)一步增強(qiáng),從而可得到一個(gè)增強(qiáng)的阻抗信號(hào)。通過(guò)以上過(guò)程,顯著地提高了傳感器檢測(cè)的靈敏度。本研究為構(gòu)建信號(hào)增強(qiáng)型電化學(xué)阻抗傳感器提供了新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：O657.1;TP212.3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 楊哲涵;基于多種信標(biāo)物質(zhì)的signal-on電化學(xué)生物傳感器的研究[D];西南大學(xué);2017年

，

本文編號(hào)：2277796