【摘要】：電化學生物傳感器具有簡單、成本低、靈敏度高等優(yōu)勢,被廣泛應于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品分析和病原微生物研究等領(lǐng)域。在電化學生物傳感器研究構(gòu)建時,利用多功能的納米材料和高效的信號放大策略改善電化學生物傳感器的各項性能,這些新方法和新技術(shù)的研發(fā),對各種生物分子特異、靈敏的檢測具有十分重要的科學意義和使用價值。本論文設計多種引入信標物質(zhì)的方法,結(jié)合多種信號放大策略和多功能化納米材料,分別制備了高通量、高靈敏、操作簡便及生物相容性好的幾種電化學生物傳感器。具體的工作如下:1.結(jié)合多標記多組分檢測策略和設計新的陣列電極構(gòu)建高通量電化學免疫傳感器的研究多標記策略可以實現(xiàn)傳感器同一界面的多組分同時測定,但是這種方法受到了標記電活性物質(zhì)數(shù)量的限制,從而限制了傳感器的檢測通量。為了提高傳感器的檢測通量,本研究將多標記多組分檢測策略與陣列電極多組分檢測方法相結(jié)合,構(gòu)建了高通量電化學免疫傳感器,達到同時對肝癌六種標志物的檢測。在本研究中,新設計的陣列電極由三個檢測點和一個對照檢測點組成。首先,在每一個檢測點上同時固載兩種不同抗原的一抗,所對應的二抗分別標記了兩種具有不同氧化還原電位的電活性物質(zhì)。在夾心免疫反應作用下,可以通過兩種電活性物質(zhì)電流峰位置的不同和峰值大小對兩種抗原的濃度進行定量。由此,在一個電極上,三個分析檢測點可以同時完成六種生物標志物的檢測,與此同時,對照檢測點可以完成空白對照的測定。另外,為了提高了傳感器檢測的靈敏度,合成了Pt Pd雙金屬/石墨烯納米片(Pt Pd-GS)用來固載二抗和辣根過氧化物酶(HRP),利用Pt Pd-GS和HRP的協(xié)同催化作用來增強電流信號。該方法與傳統(tǒng)陣列分析(每個檢測點上檢測一種蛋白),檢測通量增加了一倍。根據(jù)這種檢測模型,若在同一檢測點上同時檢測三種或四種目標物,那么傳感器的檢測通量可以增加三倍以上。本研究所構(gòu)建的檢測模型將是一個新高通量分析物測定的模型。2.高效蛋白轉(zhuǎn)化策略用于對胱抑素C的電化學靈敏檢測目前,抗體依然是蛋白質(zhì)檢測中最主要的識別元件。然而,抗體作為識別元件大大增加了核酸技術(shù)在蛋白質(zhì)檢測中的應用難度。本研究結(jié)合夾心免疫反應,鄰位觸及反應和酶剪切目標循環(huán)策略設計了一個蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)換體系,將蛋白質(zhì)的檢測轉(zhuǎn)換為DNA的測定,在進行DNA測定時,再引入了將雜交鏈式反應(HCR),從而成功的將HCR應用到蛋白質(zhì)檢測當中。在該蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換體系中,一個目標物(如胱抑素C)的輸入可以轉(zhuǎn)換為多個單鏈DNA的輸出,從而提高了蛋白質(zhì)檢測的靈敏度。同時,輸出的單鏈DNA再作為引發(fā)DNA在電極表面引發(fā)HCR,使電極表面產(chǎn)生大量的雙鏈DNA聚合物,最后通過雙鏈DNA聚合物和電活性物質(zhì)硫堇(Thi)之間的靜電吸附的作用,將大量的Thi固載到電極表面,從而輸出可測的電化學信號。通過電極表面的HCR放大技術(shù),進一步的提高了蛋白質(zhì)檢測的靈敏度。通過以上設計,成功的將酶剪切目標物循環(huán)和HCR兩種核酸技術(shù)應用在蛋白質(zhì)檢測當中。實驗結(jié)果表明該方法切實可行,具有檢測限低、選擇性好等特點。3.Cu、Mn雙摻雜的二氧化鈰納米球作為信號標簽和信號放大器構(gòu)建的信號增強型電化學生物傳感器電化學生物傳感器構(gòu)建中電信號的來源主要是依賴于具有電化學活性染料小分子。對納米材料自身作為信號標簽的關(guān)注還比較少。本研究合成了Cu、Mn雙摻雜的二氧化鈰納米球(CuMn-CeO_2)作為信號標簽、載體和催化劑構(gòu)建了電化學免疫傳感器用于對降鈣素原(PCT)的測定。通過Cu、Mn雙摻雜的作用,改善了CeO_2本身的電化學性能,使傳感器的電流信號直接來源于CuMn-CeO_2,不需要再引入額外的電活性物質(zhì)作為標簽。同時,由于CuMn-CeO_2對H2O2的氧化具有良好的催化作用,在測試底液中加入H2O2時,二抗生物耦合物中的CuMn-CeO_2會催化H2O2氧化的同時促進Ce3+/Ce4+之間的電子傳輸,從而增強了電流信號,提高了檢測的靈敏度。此外,CuMn-CeO_2不需要再經(jīng)過其他的化學修飾就可直接作為載體固載PCT第二抗體。在該研究中,CuMn-CeO_2這種納米材料同時作為信號標簽、載體和信號放大器,大大地簡化了傳感器的構(gòu)建步驟。本研究成功地利用納米材料作為電活性物質(zhì)來構(gòu)建電化學生物傳感器,拓展了納米材料的應用范圍。4.基于堿性磷酸酯酶和Hemin/G-四分體催化氧化1-萘酚構(gòu)建的信號放大型凝血酶適體傳感器的研究文獻報道堿性磷酸酯酶是一類可以催化不具有電化學活性的底物水解生成具有電化學活性的物質(zhì)的生物酶。由此,堿性磷酸酯酶廣泛應用在構(gòu)建電化學生物傳感器當中。同時,這類傳感器還結(jié)合了化學氧化還原循環(huán)放大策略來增強電化學信號去提高檢測的靈敏度。這種信號放大策略是通過向測試底液中加入的強還原劑得以實現(xiàn),但是,強還原劑的引入會致使堿性磷酸酯酶和生物分子的活性在一定程度上受到影響。本研究提出利用生物相容性好的Hemin/G-四分體作為催化劑,在H2O2存在的情況下,直接高效地催化氧化在電極表面原位產(chǎn)生的電活性物質(zhì)1-萘酚來構(gòu)建信號放大型電化學凝血酶適體傳感器。在該傳感器中,首先利用堿性磷酸酯酶催化水解1-萘酚磷酸酯,在電極表面原位產(chǎn)生了電活性物質(zhì)1-萘酚,從而輸出一個可測量的電化學信號。在加入H2O2后,Hemin/G-四分體會高效催化氧化1-萘酚,從而使輸出的電流密度增加。為了進一步增強輸出電流,將具有良好導電性的Au納米修飾的ZnO納米花作為載體用于增加生物分子的固載量,為電子傳輸提供良好的微環(huán)境。本研究探究了Hemin/G-四分體的新的催化活性,同時為基于堿性磷酸酯酶的電化學傳感器提供了新的信號放大策略。5.基于DNA水凝膠和pH刺激信號放大構(gòu)建的電化學阻抗傳感器的研究電化學阻抗傳感器一般是基于目標物自身阻礙電子傳遞所引起的阻抗變化來實現(xiàn)目標物的定量測定,其靈敏度較低。若目標物能夠引發(fā)生成一些對電子傳遞具有更強的阻礙作用的物質(zhì)生成,從而能夠顯著提高檢測靈敏度。本研究通過目標物誘導形成對電子傳遞阻礙作用更強的水凝膠生成,再結(jié)合pH刺激增加水凝膠密度的方式來放大阻抗信號,構(gòu)建了信號放大型阻抗傳感器用于對乙酰肝素酶(HPA)的電化學檢測。首先,在有目標物HPA存在時,HPA將引發(fā)DNA雜交從而在電極表面上形成水凝膠,同時將HPA包裹在水凝膠中。由于水凝膠和HPA都對電子傳遞具有阻礙作用,因此,可以得到一個與HPA濃度相關(guān)的阻抗信號。此外,在形成的水凝膠中,還設計有對H+有響應作用的DNA。當改變水凝膠的pH至5.0時,H+將會誘導所對應的DNA發(fā)生折疊促使水凝膠的密度增加,使水凝膠阻礙電子傳輸?shù)淖饔眠M一步增強,從而可得到一個增強的阻抗信號。通過以上過程,顯著地提高了傳感器檢測的靈敏度。本研究為構(gòu)建信號增強型電化學阻抗傳感器提供了新思路。
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【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：O657.1;TP212.3

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1 楊哲涵;基于多種信標物質(zhì)的signal-on電化學生物傳感器的研究[D];西南大學;2017年

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本文編號：2277795