本文選題：恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)　切入點(diǎn)：生物傳感　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：實(shí)現(xiàn)高靈敏,高特異,快速,準(zhǔn)確以及高通量的生物標(biāo)志物檢測,對(duì)癌癥的診斷,治療,預(yù)防,以及分子生物學(xué)的研究有著極其重要的科學(xué)意義。由于恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)具有靈敏度高,操作簡便,應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢,近年來被科學(xué)家們廣泛應(yīng)用于生物傳感器的制備和應(yīng)用中。在這一研究背景下,本課題利用交叉學(xué)科的技術(shù)手段,致力于設(shè)計(jì)和開發(fā)高效能的生物傳感器,并將其應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)中。通過利用一些納米結(jié)構(gòu),比如分子信標(biāo)探針,納米金,和石墨烯等,可以極大的改善恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的性能,提高其應(yīng)用能力。本論文的主要研究內(nèi)容包括以下四個(gè)方面：1.設(shè)計(jì)了一種雙標(biāo)記的納米金探針,首次提出了一個(gè)雙向四態(tài)的分析理論用于檢測尿液樣本中的端粒酶,并進(jìn)一步用于膀胱癌的診斷。本方法的多態(tài)性表現(xiàn)在,對(duì)于不同活性和濃度的端粒酶,納米金會(huì)表現(xiàn)出四種狀態(tài)：沉淀,紅色透明,紫色,以及藍(lán)色。雙向性表現(xiàn)在,納米金的四態(tài)和其對(duì)應(yīng)的A650/A520的比值是雙向的,類似于坐標(biāo)軸。A650/A520比值最小的是紅色的納米金,代表原點(diǎn)。隨著沉淀越來越明顯,4650/A520比值增大,這個(gè)代表正方向。隨著納米金顏色由紫色變成藍(lán)色,A650/A520比值也在增大,這個(gè)代表負(fù)方向�；谶@一策略,我們檢測了18例臨床尿液樣本(包括正常人,炎癥患者,以及膀胱癌病人),證明了本方法具有很好的臨床診斷能力。2.首次完成了利用納米金監(jiān)測復(fù)雜環(huán)境中的鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。隨著鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)的充分進(jìn)行,肉眼可以觀測到納米金由藍(lán)色到紅色的變化。另外對(duì)靶分子參與反應(yīng)的14個(gè)位點(diǎn)的堿基進(jìn)行點(diǎn)改變,發(fā)現(xiàn)這14條具有點(diǎn)突變的序列并不能使得納米金的顏色發(fā)生變化,說明本方法具有很好的檢測點(diǎn)突變的能力。另外本方法在復(fù)雜環(huán)境中也可以順利進(jìn)行,具有較好的實(shí)用性。本研究極大地拓寬了鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)的應(yīng)用范圍。3.為了能夠提高癌癥早期診斷的準(zhǔn)確性,我們提出了單體系雙標(biāo)志物檢測的方法。本方法可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA和端粒酶的檢測。通過利用切刻酶引發(fā)的擴(kuò)增反應(yīng),以及對(duì)DNA序列的巧妙設(shè)計(jì),我們成功的將端粒酶的延伸反應(yīng)以及miRNA誘發(fā)的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)合二為一,并且將檢測信號(hào)進(jìn)行了放大。另外本方法還用到了石墨烯來降低背景信號(hào),以達(dá)到更好的檢出效果。通過對(duì)近300例病人尿液樣本的分析,結(jié)果證明,和miRNA檢測或端粒酶的檢測方法相比,miRNA和端粒酶雙檢的方法不僅具有較高的靈敏度,而且特異度也大大的提高了。尤其是本方法可以對(duì)浸潤性和非浸潤性的膀胱癌病人進(jìn)行區(qū)分,從而為癌癥的早期診斷提供了新思路。4.為了實(shí)現(xiàn)快速高靈敏度的檢測miRNA,我們提出了一種基于恒溫雙循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的一步分析法。我們設(shè)計(jì)了一條多功能的分子信標(biāo)探針,并在切刻酶,消化酶,聚合酶的參與下完成一個(gè)雙循環(huán)反應(yīng),并達(dá)到了指數(shù)擴(kuò)增的能力。本方法在37℃的情況下可以檢測到10 fM的miRNA。而在4℃下可以檢測到1 aM的miRNA,相當(dāng)于在15μL的樣本中可以檢測到9條DNA鏈。最后將本方法應(yīng)用于癌細(xì)胞系甚至于癌組織中miRNA的檢測時(shí),也表現(xiàn)出了很好的特異性和靈敏度,為癌癥的早期診斷提供了新方法。
[Abstract]:To achieve high sensitivity, high specificity, rapid, accurate and high-throughput biomarkers for cancer detection, diagnosis, treatment, prevention, has extremely important scientific significance and research of molecular biology. The isothermal amplification reaction has high sensitivity, simple operation, wide application range and other advantages, in recent years by scientists. Widely used in the fabrication of biosensors and application. In the context of this study, this paper uses technology of cross discipline, dedicated to the design and development of biosensors with high efficiency, and its application in clinical examination. Through the use of some nano structure, such as molecular beacon probe and gold nanoparticles. Graphene can greatly improve the performance, the constant temperature amplification reaction, improve the ability of application. The main research contents of this thesis include the following four aspects: 1. design of a double labeled gold nanoparticle probes for the first time. Theoretical analysis of a two-way four state for the detection of telomerase activity in urine samples is proposed, and further for the diagnosis of bladder cancer. The polymorphism of this method in the performance of, for different activity and concentration of telomerase, gold nanoparticles exhibit four states: precipitation, transparent red, purple, and blue. Bidirectional performance in the four state, the ratio of gold nanoparticles and their corresponding A650/A520 is two-way, similar to the.A650/A520 axis ratio is the smallest nano gold, red represents the origin. With the precipitation is more and more obvious, the ratio of 4650/A520 was increased, the generation of surface orientation. With nano gold color from purple to blue, the ratio of A650/A520 in this increase represents the negative direction. Based on this strategy, we detected 18 cases of clinical urine samples (including normal, inflammation, and bladder cancer patients), proved that this method has good clinical diagnosis .2. completed the first chain replacement by using gold nanoparticle monitoring in complex environment with sufficient amplification. Strand displacement amplification reaction, the naked eye can be observed from blue to red gold nanoparticles changes. In addition to the 14 sites of target molecules involved in the reaction of the base point of change, has found that the 14 point mutation the sequence that does not change the color of gold nanoparticles, this method has good ability to detect point mutations. Also this method can be carried out smoothly in the complex environment, has better practicability. This study greatly expands the application range of.3. strand displacement amplification reactions in order to improve the accuracy of early diagnosis of cancer, we put forward a new method of single system of double marker detection. This method can realize the detection of miRNA and telomerase. By using enzyme cutting by amplification reaction, and The ingenious design of DNA sequences, we successfully extend reaction telomerase, rolling circle amplification reaction induced by miRNA and will be made one, detection signal is amplified. This method is also used to reduce the background signal of graphene, in order to achieve better detection result. Through the analysis, nearly 300 cases of patient urine samples the results prove that, compared with the detection method and miRNA detection method of miRNA or telomerase, telomerase and double check not only has high sensitivity and specificity are greatly improved. Especially the method can distinguish between invasive and non invasive bladder cancer patients, so as to early diagnosis of cancer provides a new idea in order to realize the rapid detection of miRNA.4. with high sensitivity, we propose a step analysis method based on double circulation constant temperature amplification reaction. We design a multifunctional molecular letter Probe, and engraved in enzyme digestion enzymes, to complete a double cycle reaction polymerase participation, and ability to achieve exponential amplification. This method can detect 10 fM miRNA. at 4 DEG C can be detected by 1 aM miRNA at 37 DEG C under the condition of the equivalent of 15. The L sample was detected in 9 DNA strands. Finally this method is applied to cancer cells even in the detection of miRNA in cancer tissue, also showed good specificity and sensitivity, it provides a new method for early diagnosis of cancer.

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TB383.1;TP212.3

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本文編號(hào)：1596611