本文關(guān)鍵詞： 生物傳感器 納米材料 石墨相氮化碳 氧化石墨烯 非標記 酶活性 比率熒光檢測 熒光活化成像 多肽自組裝　出處：《湖南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：近年來,納米材料由于其優(yōu)異的物理化學(xué)性能,已成為當前研究的熱點,納米材料的應(yīng)用更是為生物傳感器的快速發(fā)展提供了新的活力。由納米技術(shù)與生物傳感器結(jié)合所組成的納米生物傳感器,涉及到化學(xué)、生物及納米科學(xué)等多個交叉學(xué)科的應(yīng)用,在生物傳感器的基礎(chǔ)理論研究中提供了許多創(chuàng)新性的思路。納米生物傳感器可以開發(fā)出新型檢測原理和傳感機制,大大提升了生物傳感器的檢測速度和分析性能,在臨床檢測、醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域有著越來越重要的影響。本論文以生物功能重要的重大疾病相關(guān)的標志物(如蛋白質(zhì)、酶、糖等)為研究對象,結(jié)合新興二維納米材料(氧化石墨烯和石墨相氮化碳),發(fā)展了一系列簡單、快速、高靈敏度和高選擇性的新型納米生物傳感方法。此外,針對當前生物成像探針生物相容性差,容易出現(xiàn)假陽性信號等問題,利用多肽自組裝技術(shù),開發(fā)了新穎的多肽自組裝納米粒子用于活細胞的高靈敏、高選擇性檢測。研究論文的主要內(nèi)容概括如下:為了進一步拓寬熒光二維納米材料-石墨相氮化碳(g-C_3N_4)納米片在非金屬離子光學(xué)生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用,在第2章中,我們發(fā)展了一種新的基于g-C_3N_4納米片的傳感器用于一步、非標記、高靈敏檢測酪氨酸酶(TYR)活性及其抑制劑篩選。由于g-C_3N_4納米片的高比表面積和大π系統(tǒng),基于酪氨酸酶可以高效催化酪氨酸生成各類的黑色素類聚合物,黑色素類寡聚體易于組裝在g-C_3N_4納米片表面,并原位逐漸生長成黑色素類聚合物最終猝滅g-C_3N_4納米片的熒光。該傳感策略對酪氨酸酶活性分析具有高的靈敏度和選擇性,并能夠用于快速的酪氨酸酶抑制劑篩選。因此,該方法建立了一個新的傳感平臺用于包括黑色素瘤在內(nèi)的酪氨酸酶類相關(guān)疾病的早期診斷及其抑制劑篩選。過氧化氫(H_2O_2)和葡萄糖是細胞內(nèi)重要生理因子之一,細胞內(nèi)的H_2O_2的紊亂或累積可導(dǎo)致多種嚴重疾病如中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或癌癥的產(chǎn)生,而血液中葡萄糖水平的高低與血糖癥密切相關(guān),因此,H_2O_2和葡萄糖的檢測在研究生理和病理過程中具有重要作用。在第3章中,我們首次建立了一種基于g-C_3N_4納米片的比率型熒光探針用于H_2O_2和葡萄糖的高靈敏檢測。在辣根過氧化物酶(HRP)催化作用下,鄰苯二胺(OPD)被H_2O_2氧化為其相應(yīng)的氧化產(chǎn)物(OX~(OPD)),由于g-C_3N_4納米片的高比表面積和大π系統(tǒng),生成的OXOPD通過氫鍵和π-π堆積作用力組裝于g-C_3N_4納米片表面,通過光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)猝滅g-C_3N_4納米片的熒光的同時,伴隨發(fā)出一個新的熒光峰。通過測量其比率熒光信號可以高靈敏的檢測H_2O_2。由于葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下可特異性生成H_2O_2,該方法可進一步應(yīng)用于葡萄糖的檢測。本章發(fā)展的分析方法對H_2O_2和葡萄糖的檢測下限分別為50 n M和0.4μM,并且都具有良好的選擇性,該傳感策略提供了一種涉及生成H_2O_2的反應(yīng)物種的高通量的檢測平臺。為了進一步拓寬g-C_3N_4納米片在生物成像方面的應(yīng)用,在第4章中,我們利用g-C_3N_4納米片優(yōu)越的負載能力,構(gòu)建了一個腫瘤靶向性的納米組裝體用于透明質(zhì)酸酶(HAase)的檢測,并用于活細胞內(nèi)透明質(zhì)酸酶激活的雙光子成像分析。使用透明質(zhì)酸(HA)為模版一步還原合成HA包裹的納米金(HA-Au NPs),所合成的HA-Au NPs通過靜電吸附和疏水作用力組裝在g-C_3N_4納米片表面形成多功能納米組裝體。由于HA-Au NPs和g-C_3N_4納米片之間發(fā)生有效的熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET),使得g-C_3N_4納米片的熒光被猝滅。多功能納米組裝體在HA受體(CD44)的作用下特異性進入腫瘤細胞,細胞內(nèi)高表達的HAase特異性地水解固定在g-C_3N_4納米片表面的HA-Au NPs,使得Au NPs從g-C_3N_4納米片表面脫落,納米組裝體解離,從而產(chǎn)生激活的雙光子成像信號。過氧化氫(H_2O_2),一種重要的生化分子,在調(diào)節(jié)各種生理過程中起著非常關(guān)鍵的作用。在第5章中,我們在氧化石墨烯(GO)表面在熒光標記DNA的引導(dǎo)下直接合成AgNPs得到納米復(fù)合物(AgNPs-DNA@GO),在納米復(fù)合物中,由于GO和AgNPs的雙重猝滅效應(yīng),使得DNA熒光大大減弱。當加入H_2O_2時,H_2O_2與AgNPs相互作用產(chǎn)生羥基自由基(?OH),能有效腐蝕AgNPs并裂解DNA,從而導(dǎo)致納米復(fù)合物的解離,最終熒光恢復(fù)。通過該方法可以高靈敏的檢測H_2O_2并進一步應(yīng)用于葡萄糖的檢測。癌癥,是當今嚴重威脅人類健康的主要疾病之一,早期診斷并及時治療是治療癌癥的關(guān)鍵。高靈敏的癌細胞成像對于癌癥的早期診斷具有非常重要的意義。在第6章中,我們通過設(shè)計多肽序列使其自發(fā)組裝成多肽納米粒子用于特異性的癌細胞高靈敏成像。本研究中,我們設(shè)計了一組兩親性彈性蛋白肽,其疏水區(qū)含有對組織蛋白酶B(Cat B)特異性響應(yīng)并熒光供受體對標記的多肽序列以及對pH敏感的富含組氨酸的多肽序列;其親水區(qū)含有特異性響應(yīng)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP 2)的多肽序列,在生理條件下,兩親性彈性蛋白肽組裝成納米粒子,在癌細胞中,癌細胞高表達的MMP 2特異性響應(yīng)活化細胞穿膜肽介異多肽納米粒子進入細胞,由于癌細胞內(nèi)低的pH值,使pH敏感的多肽納米粒子解組裝,同時,癌細胞內(nèi)溶酶體內(nèi)高表達的Cat B切割其特異性序列,從而激活熒光成像。本研究所建立的多肽納米粒子利用癌細胞生理環(huán)境,通過逐級激活納米粒子,實現(xiàn)了對癌細胞高靈敏高特異性成像。
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【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TB383.1;TP212.3

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳玲;;生物傳感器的研究進展綜述[J];傳感器與微系統(tǒng);2006年09期

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本文編號：1509395